禽流感病毒檢測技術(shù)的研究新進(jìn)展
禽流感（ＡＩ）是由Ａ型流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的感染和／或疾病綜合癥,。禽流感病毒屬正黏病毒科流感病毒屬,，典型病毒粒子為球形,，直徑８０～１２０ｎｍ，有時(shí)呈絲狀體等形態(tài),。至今已發(fā)現(xiàn)Ａ型流感病毒的血凝素（ＨＡ）有１６種,，神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）有９種（傅生芳，２００５）,，根據(jù)表面糖蛋白ＨＡ和ＮＡ的抗原性差異可以分為１６個(gè)ＨＡ亞型和９個(gè)ＮＡ亞型,，不同亞型病毒之間可以通過交換某些基因片段發(fā)生基因重排，出現(xiàn)具有新的生物學(xué)特征的病毒,，因此,，ＡＩＶ 最顯著的生物學(xué)特征之一就是亞型眾多。而且,，不同亞型或血清型之間無交叉反應(yīng)性或反應(yīng)性低,，這使得禽流感的診斷監(jiān)測工作較為困難。禽流感根據(jù)ＡＩＶ致病力的強(qiáng)弱可分為高致病性（ＨＰＡＩＶ）和低致病性（ＬＰＡＩＶ）,，前者不僅可以引起家禽死亡,，還可以造成人的感染死亡，因此，控制ＡＩＶ的發(fā)生和流行具有重要意義,。文章就禽流感近幾年的研究,，尤其是在病原學(xué)檢測、免疫分
析方法和分子生物學(xué)檢測方法的研究進(jìn)行了綜述,。
１ 病原學(xué)檢測
１．１ 病毒的分離鑒定
ＡＩＶ 在雞胚中生長良好,，將疑似病料經(jīng)適當(dāng)處理接種在９～１０日齡的雞胚中，分離培養(yǎng)病毒,。若檢測出有凝血活性，可進(jìn)一步確定分型,；若無凝血活性,，則認(rèn)為未分離到病毒（趙翠燕等，２００３）,，該方法具有精確,、敏感的優(yōu)點(diǎn)，但操作繁瑣,，耗時(shí)較長,，需要１周左右的時(shí)間。
１．２ 電鏡技術(shù)
利用電鏡技術(shù)可以直觀準(zhǔn)確地鑒別病毒,，根據(jù)病毒自身的形態(tài),、結(jié)構(gòu)等不同特征，能很快做出診斷,。檢驗(yàn)結(jié)果與樣品制備技術(shù),、收取病料的部位和時(shí)間有關(guān)，電鏡法不能用于亞型及致病性的測定且其受到設(shè)備的限制,，投入資金較大（劉志杰等,，２０１１）
２ 免疫分析技術(shù)
２．１ 免疫傳感技術(shù)
隨著生物傳感器的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了生物傳感器微陣列,、微系統(tǒng),，該技術(shù)靈敏度高、響應(yīng)快,，不需要標(biāo)記,，既可定性又可定量，克服了傳統(tǒng)檢測方法費(fèi)時(shí),、昂貴,、標(biāo)記及操作繁瑣等缺點(diǎn)，具有極廣泛的發(fā)展前景及臨床使用價(jià)值,，成為生物傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)（姚春艷等,，２００６）。免疫識別膜的固定化技術(shù)是生物傳感器制作的核心部分，其固定化技術(shù)決定著生物傳感器的選擇性,、靈敏度,、穩(wěn)定性和壽命等主要性能，也決定著生物傳感器是否有研究和應(yīng)用價(jià)值,。詹愛軍等（２００９）將石英晶片諧振的高靈敏度與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合,，用蛋白Ａ（ＳＰＡ）在鍍金膜的石英晶體電極偶聯(lián)抗Ｈ９亞型流感病毒的單抗構(gòu)建傳感器探頭形成免疫傳感器。檢測結(jié)果表明,，該方法具有較好的特異性,，不與Ｈ５亞型禽流感病毒和新城疫病毒（ＮＤＶ）反應(yīng)，檢測靈敏度達(dá)到２０ＥＩＤ５０,，組成的檢測器對相應(yīng)的流感病毒響應(yīng)良好,，該法與雞胚病毒分離法檢出流感病毒的符合率達(dá)到９１％。林向華等（２００９）以ＡＴ切型,、基頻１０ＭＨｚ的石英晶體為材料,，設(shè)計(jì)四通道芯片微陣列。采用聚乙烯亞胺黏附—戊二醛交聯(lián)法
將禽流感Ｈ５,、Ｈ９亞型單克隆抗體固定在石英晶體的金膜電極表面制備生物敏感膜,，構(gòu)建可用于同步檢測禽流感Ｈ５、Ｈ９亞型的壓電免疫芯片,。構(gòu)建的壓電免疫芯片用于檢測Ｈ５,、Ｈ９亞型抗原和疑似樣品，其各自的響應(yīng)值與空白對照的噪聲值之比均大于２,，試驗(yàn)構(gòu)建的壓電免疫芯片可用于禽流感Ｈ５,、Ｈ９亞型的定性檢測。
２．２ 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)
蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量,、高靈敏度,、自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，在蛋白質(zhì)組的功能研究,、疾病診斷及藥物開發(fā)中顯示出巨
大的應(yīng)用潛力（Ｓａｎｇ等,，２００８）。石霖等（２００９）制備了可以同時(shí)鑒別診斷禽流感（ＡＩ）,、新城疫（ＮＤ）２種
禽病血清抗體的可視化蛋白質(zhì)芯片,，將芯片與待檢血清雜交后，再與膠體金標(biāo)記的二抗雜交,，銀染顯色后根據(jù)灰度值判定結(jié)果,，該可視化蛋白質(zhì)芯片具有很好的特異性，?Z?X暅 并且檢測靈敏度是瓊脂糖凝膠擴(kuò)散（ＡＧＰ）方法的４００倍以上,。研究結(jié)果表明,，該方法可用于同步鑒別兩種禽病,，是一種有效的抗體檢測新方法。該技術(shù)不僅保留了抗原—抗體反應(yīng)快速,、靈敏和特異性的特點(diǎn),，還可以滿足生物樣本多指標(biāo)分析的需要，因此更利于大規(guī)模推廣應(yīng)用（Ｓｍｉｔｈ等,，２００６）,。
２．３ 膠體金免疫層析法
陳洪等（２００７）用膠體金顆粒標(biāo)記Ｈ５ 亞型禽流感病毒單克隆抗體Ａ（Ｂ５Ｃ７），用羊抗鼠ＩｇＧ和Ｈ５亞型禽流感病毒單克隆抗體Ｂ（３Ｃ４）噴涂于硝酸纖維膜質(zhì)控線和檢測線上,，研制出Ｈ５亞型禽流感病毒抗原金標(biāo)快速診斷試紙條,。用禽流感Ｈ
５、Ｈ９標(biāo)準(zhǔn)抗原和新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原作為檢測抗原對研制的試紙條進(jìn)行特異性,、敏感性和穩(wěn)定性試驗(yàn),，試驗(yàn)結(jié)果表明該方法操作簡單、靈敏度高,、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,，具有良好的應(yīng)用前景,。單抗介導(dǎo)的斑點(diǎn)免疫金滲濾法（ＤＩＧＦＡ）是利用Ａ型禽流感單克隆抗體和膠體金標(biāo)記技術(shù)建立的快速檢測ＡＩＶ方法。敏感性高于ＨＡ診斷方法,，２０～３０ｍｉｎ即可出結(jié)果,，ＤＩＧＦＡ 具有不需試驗(yàn)設(shè)備、可用肉眼判定,、方法簡便,、試劑用量少、對人體無害等優(yōu)點(diǎn)（雷彩俠,，２００７）,。
２．４ 熒光抗體試驗(yàn)
免疫熒光技術(shù)（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｓｓａｙ，ＩＦＡ）是利用被標(biāo)記上熒光色素的抗原（或抗體）特異性地與抗體（或抗原）結(jié)合,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)來進(jìn)行觀察的檢測方法,。最早用于鑒定ＡＩＶ 的ＮＰ和ＭＰ抗原，１９６１年開始用于人類流感的快速診斷,。秦愛建等（２００３）研制了抗禽流感Ｈ５和Ｈ９亞型病毒的單克隆抗體,，建立了免疫熒光方法檢測ＡＩＶ，可以檢測出相應(yīng)的Ｈ５亞型病毒,。建立在單克隆抗體基礎(chǔ)上的免疫熒光方法具有快速,、簡便、易行,、較敏感等特點(diǎn),，也常用于臨床診斷,，但出現(xiàn)假陽性的幾率較高。
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