成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：
凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來,，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析,。
吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上,，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析,。
處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上,。
處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸,，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測。
成功進行WB檢測,，則設置合適正確的對照是必不可少的,，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在,，并保證實驗結(jié)果的準確性和特異性,！一般需要設置的對照如下：
陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率
陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞,，用于檢測抗體的特異性
二抗對照：不加一抗,，用于檢測二抗的特異性
內(nèi)參對照：檢測標本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)
空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果
WB檢測基本過程
1,、獲取細胞或組織裂解物
1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：
)選擇合適的蛋白酶抑制劑,，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性,！
2,、蛋白定量
常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,，可根據(jù)情況將標本保存在-20°C /-80°C備用,，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白
3、電泳分離蛋白質(zhì)
根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件
根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度
4,、轉(zhuǎn)膜
根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型,。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜,，其中PVDF和NC膜的使用頻率最高,。
5、封閉
去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點,，降低背景,。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS
6、一抗孵育
一抗的選擇成功與否,，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：
選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）
選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）
選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體
一抗的保存和使用：
根據(jù)說明書的要求條件進行抗體的保存,；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，絕對避免反復凍融,。
抗體的工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用,，在4度保存最好不要超過2周
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異,，說明書推薦的稀釋比例只作參考,，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比最好的抗體濃度進行實驗,。如果說明書沒有推薦濃度,，可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度（1:100-1:3000）,。
孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時）,，根據(jù)抗體親和力不同孵育時間有所區(qū)別
內(nèi)參的選擇和使用：WB過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標準,！
7、二抗孵育
根據(jù)說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗,。如果說明書沒有推薦濃度,，可進行多個稀釋比例進行摸索最佳稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時
8,、底物孵育
選擇顯色或者化學發(fā)光底物,。一般傾向于化學發(fā)光，靈敏度高且背景低,，節(jié)省抗體用量
9,、結(jié)果分析和檢測
凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片
Note：從封閉開始，每步之間都需要用TBST進行洗滌,，3次,，每次5min
