一,、原核細(xì)胞表達(dá)載體

1.  pBAD載體:

該載體中,，表達(dá)質(zhì)粒含有araBAD(arabinose)操縱子的PBAD啟動(dòng)子和編碼該啟動(dòng)子的正負(fù)調(diào)控子基因araC,，具有緊密調(diào)控功能和高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的原核細(xì)胞表達(dá)載體,。

使用該載體實(shí)驗(yàn)時(shí)請注意: 

1．當(dāng)要扦入其他信號肽片段,，改建此載體時(shí),，請不要利用該載體上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位點(diǎn)，以免造成重組困難,，因?yàn)榍笆鰞?nèi)切酶在此載體上均有二個(gè)位點(diǎn),，最好使用只有一個(gè)酶切位點(diǎn)的Sac1和Hind111位點(diǎn)。同時(shí)記住,，如在不含任何信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒扦入信號肽,，其非編碼N-末端要包含核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)核苷酸序列,。

2． 在使用含Omp A分泌信號肽的PBAD表達(dá)質(zhì)粒時(shí),，請應(yīng)用Omp A分泌信號肽上的Sac1以及載體Hind11酶切位點(diǎn),，這些在載體序列上都是單個(gè)酶切位點(diǎn)。

2．pCAl-n & pCAl-pelB載體

該原核細(xì)胞表達(dá)載體是來源于以T7 RNA聚合酶為基礎(chǔ)的pET載體,，含有T7/LacO啟動(dòng)子,、編碼鈣調(diào)素結(jié)合多肽標(biāo)鑒和凝血酶切點(diǎn)的核苷酸序列。因此,，該表達(dá)載體在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì),、且這種表達(dá)的外源蛋白質(zhì)因帶有鈣調(diào)素結(jié)合多肽和凝血酶切點(diǎn)，故該蛋白產(chǎn)物易于純化和產(chǎn)業(yè)化,。

(a).  Pcal-n

   M  K R R W K K N F I A V S A A N R F K K I S S S G A L L V P

CATATG AAG GGACGATGGAAAAAACAATTTCATAGCCGTCTCAGCAGCCAACCCGCTTTAAGAAAATCTCATCCTCCGGGGCACTTCTGGTTCC

 Nde1

  R G S P G I L D S M G R L E L K L R S A

GCGTGGATCCCCGGGAATTCTAGACTCCATGGGTCGACTCGAGCTCAAGCTTAGATCCGCC

BamH1   Sma1   EcoR1        Nco1   Sal1   Xho1   Sac1    Hnd111

(b). Pcal-PelB:

Nde1                                           

actggagact catATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCG GCC CAG GGC

   M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P

 Nco1  Msc1  BamH1  EcoR1  Sal1

GCC ATG GCC  aaggatcctaagtaagtagaattctgagtaggtaagtcgacaatcgcgtctagagccc cgacgcgctggg

 A  M   A      *  *  *    *  *  *

3.  pPOW3.0 表達(dá)載體

該原核表達(dá)質(zhì)粒含有噬菌體的重疊λPRPL熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子和編碼熱敏感抑制子的C1857基因,，可使宿主細(xì)胞在合成蛋白前獲得高密度的宿主細(xì)菌，進(jìn)行高水平目的蛋白表達(dá),，并對蛋白合成提供緊密控制,。PelB分泌信號肽能指引合成的外源蛋白通過胞漿膜進(jìn)入胞質(zhì)。

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