用免疫磁珠做細胞分選(MACS)是高效簡捷的免疫細胞及其它細胞的分離純化方法。 原理是已包被一抗的磁珠與細胞表面相應(yīng)分子特異性結(jié)合,，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠與預(yù)先已與細胞表面分子特異結(jié)合的一抗結(jié)合,。磁珠攜帶與之結(jié)合的細胞吸附于分離柱/試管上,，實現(xiàn)陽性細胞分離或陰性細胞的分離。本節(jié)介紹超微磁珠間接標(biāo)記,、用分離柱陽性分選細胞的方法,。
Protocal：
1.離心收集待分離細胞，用少量PBE孵育液(0.5％BSA,、0.08％EDTA PH7.2 PBS,，真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體)充分混懸細胞(0.5ml/1×108細胞)，加入一抗(10~20μg/ml終濃度),，4° C孵育30分鐘,。
2.用20倍體積PBE洗細胞一次，再加PBE(0.3ml/1×108細胞)充分混懸細胞后,，加入相應(yīng)二抗包被的超微磁珠,，混勻后置8~15° C孵育10~15分鐘。
3.將分離柱安裝入磁場中,，加入0.5ml PBE,，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離
柱,。
4.將孵育完的細胞懸液加到分離柱中,，自然流盡。
5.以0.5ml的PBE加到分離柱中，自然流盡,，洗柱兩次,。
6.從磁場中取下分離柱，插在試管口,，加1-2ml的PBE,，用針芯推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細胞,，用培養(yǎng)基洗一次,，待用。
注：
1.如果分離細胞用作培養(yǎng),，全過程在超凈臺中完成,。
2.超微磁珠及微小磁場系統(tǒng)適合于少量細胞分離(如106-107)，通常已適用于大多數(shù)實驗研究,；此外各公司尚有大磁珠及大磁場供應(yīng),，可用于更大量細胞的分選；除分離柱外,，也有試管及其它設(shè)備用于分選,；根據(jù)我們應(yīng)用的經(jīng)驗，分離柱由于提供了較大的接觸面,，在細胞分選上具有較多優(yōu)點,。磁場也可以自制,，用一般的磁鐵即可做成簡易磁場,，可提供足夠的磁力。
3.磁珠分離系統(tǒng)分離的細胞純度可以達到80~99％,，得率在60~90％左右,，僅次或相當(dāng)于流式細胞儀（FACS）的分選效率，與FACS 相比,，MACS設(shè)備簡單,，耗時極短，故而應(yīng)用廣泛,。MACS也可用做FACS分選前的預(yù)分離,，以減少FACS所用時間。另外連續(xù)兩次過柱分選可進一步提高分選細胞純度,，通?？蛇_95－99％。
4.在分離柱尾接上限速針頭,，收集的首次流下的細胞即為陰性選擇細胞,，一般純度低于陽性選擇。
5.分離柱一般只能一次應(yīng)用，再用時降低分離效率,；
6.分選下的細胞可用熒光標(biāo)記抗體(一抗或二抗)標(biāo)記后FACS鑒定純度,；我們用熒光抗體直接標(biāo)記細胞后，用二抗包被磁珠分選出細胞,，直接做FACS分析,，也可實現(xiàn)分選和純度檢測。
7.陽性選擇后,，如需用第二種表面標(biāo)志繼續(xù)分離,，可以用剪切酶剪切下之結(jié)合的磁珠和一抗，再次進行下一輪分選,。如需進行細胞功能分析,，也可經(jīng)培養(yǎng)12~24小時，使結(jié)合的磁珠脫落后進一步使用陽選的細胞做研究,。
分選的效率在很大程度上取決于實驗者對關(guān)鍵環(huán)節(jié)的把握,。我們建議實驗者在操作前認真閱讀相應(yīng)的說明書及以下特別值得提出引起重視的有以下幾點：
1.待分選細胞中如有貼壁細胞，建議在分選前先貼壁培養(yǎng)去除,，或者提高EDTA濃度,；
2.抗體包被磁珠對死細胞常有非特異性結(jié)合。因而分選前去除死細胞,；
3.新鮮分離骨髓細胞,，先用膠原酶、DNA酶,、胰酶聯(lián)合消化,，可使細胞團塊解聚，從而提高分離效率,。
4.上分離柱前,，充分振蕩，混懸細胞,，打散細胞團塊,；
5.用分離柱分選，應(yīng)用真空抽濾水,，減少水中氣泡,，使分離柱不被氣泡阻滯；
6.細胞懸液加入分離柱中時,，應(yīng)將滴管伸至底壁后加入,，避免將細懸液沿管壁流入，使管壁殘流末分選細胞,，以致后繼洗柱過程中,，因疏忽末被洗下,，最后導(dǎo)致純度不高。洗柱時,，應(yīng)在前次液體充分流盡后,，再加洗液。
7.分選細胞量應(yīng)根據(jù)說明書控制,，不超量,；
8.孵育時間和溫度應(yīng)按說明書進行，延長孵育時間,、提高溫度會增加非特異結(jié)合,；
9.先用抗體阻斷Fc受體，可降低非特異性結(jié)合,；
