將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱為原核表達(dá),。這種方法在蛋白純化,、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用,。大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白有以下特點：易于生長和控制,；用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴,；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)?？晒┻x擇,。但是,，在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象,。
表達(dá)載體在基因工程中具有十分重要的作用，原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒,，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：
（1）選擇標(biāo)志的編碼序列,；
（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動子；
（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子,，核糖體結(jié)合位點),；
（4）一個多限制酶切位點接頭；
（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列,。
原核表達(dá)一般程序如下：獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測序驗證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴增,、純化、進(jìn)一步檢測，其中包括：
一,、試劑準(zhǔn)備
（1）LB培養(yǎng)基,。
（2）100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm濾膜抽濾，-20℃保存,。
二,、操作步驟
（一）獲得目的基因
1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,，按基因序列設(shè)計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點）,，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2,、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA,，以mRNA為模板,，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
（二）構(gòu)建重組表達(dá)載體
1,、載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點）進(jìn)行雙酶切,，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段,。
2,、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體,。
（三） 獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1,、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選,，挑取單斑,，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定,。
2,、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點,。
3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞,。
（四）誘導(dǎo)表達(dá)
1,、 挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。
2,、 按1∶50比例稀釋過夜菌,，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大約需3hr）。
3,、 取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr,。
4、 分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,，用100μl 1%SDS重懸,，混勻, 70℃10min。
5,、 離心12000g×1min,，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
三 ,、注意事項
（1）選擇表達(dá)載體時,，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化,，可選擇融合表達(dá),；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá),。
（2）融合表達(dá)時在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時,，對轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。
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