目前,，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒DNA是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體,。一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素：
（1）復(fù)制起始位點(diǎn)Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物DNA分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn),。而真核生物DNA分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。
（2）抗生素抗性基因 可以便于加以檢測(cè)，如Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位點(diǎn)MCS 克隆攜帶外源基因片段
（4） P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子
（5）Terms 終止信號(hào)
（6）加poly（A）信號(hào) 可以起到穩(wěn)定mRNA作用
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的,，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因,，則要選擇合適的表達(dá)載體,。
載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：
【1】構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá),，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體,。
【2】.載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大,，小選?。Ｈ?lt;10kb選質(zhì)粒,。
（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭,，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
（3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌,，用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位,；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異,，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接,，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。
綜上所述,，選用質(zhì)粒（最常用）做載體的4點(diǎn)要求：
（1）選分子量小的質(zhì)粒,，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）,；
（2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束,，一般10個(gè)以上的拷貝,，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。
（3）必需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn),，有選擇的余地,；
（4）必需有易檢測(cè)的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因,，不特指多位Ampr（試一試）,。
無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子,，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進(jìn)行切割,，獲得分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接,。
如何閱讀質(zhì)粒圖譜
第一步：首先看Ori的位置,，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）
第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性,，決定使用什么篩選標(biāo)記,。
（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性,。
（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞,。
（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物,，使之失去毒性,。
（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 使G418（長(zhǎng)那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）,。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn),。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入,，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活,，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因,。
第四步：再看外源DNA插入片段大小,。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。一般來說,，外源DNA片段越長(zhǎng),，越難插入，越不穩(wěn)定,，轉(zhuǎn)化效率越低,。
第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào),。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體,?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體,，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩,。
第六步：?jiǎn)?dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)
（1）啟動(dòng)子－促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA順序，這個(gè)DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼順序的上游,，是DNA分子上可以與RNApol特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位,，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄,。
（2） 增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序,。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用,。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子,，負(fù)調(diào)控序列。
（3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),，對(duì)于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列,。
（4） 轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū),，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào),。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè)AATAAA的保守序列，此位點(diǎn)down－stream有一段GT或T富豐區(qū),，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號(hào),。
質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條DNA鏈,，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上.
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