核桃揪皮為胡桃科核桃屬植物核桃揪的樹皮·其樹皮,、根皮、葉片,、未成熟外果皮及外殼均可人藥.現(xiàn)代研究表明,核桃揪具有抗氧化,抗菌,、消炎、抗誘變{"]和抗癌’5)等作用其含有多種抗腫瘤活性成分,如胡桃醒5伙榭皮素{和鞭花酸}l等報道胡桃醒可直接抑制體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖.但其提取的其他活性部分臨床研究報道較少.我們選用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721作為研究對象,觀察核桃揪樹皮提取物的抗腫瘤效應(yīng),采用嚷哩藍(lán)(M'1~I')法測定核桃揪皮甲醇提取液對SMMC-7721的抑制率.
一,、材料與方法
1,材料:RPMI1640粉末(Gihc.公司);M'I`T(Simga公司);二甲基亞颯(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);5一氟尿嚓u;}(5-Fu,江蘇恒瑞制藥有限公司,批號08031021);小牛lfJl清(杭州四季青);胰蛋白酶(Gibc.公司);十二水合磷酸氫二鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);磷酸二氫鉀(沈陽市試劑廠);核桃揪樹皮(采自黑龍江省牡丹江牡丹江峰);SMMC-7721瘤株(牡丹江醫(yī)學(xué)院抗腫瘤研究所提供);酶標(biāo)白動分析儀(美國MolecularDevices).
2.核桃揪樹皮有效成分的提取:精密稱取核桃揪樹皮樣品5009,以乙醚回流48h,剩余物以甲醇回流48h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收甲醇轉(zhuǎn)水溶,過濾,濃縮,烘干,得到樣品.
3.細(xì)胞培養(yǎng):SMMC-7721細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%新生牛血清和青霉素,、鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液中.培養(yǎng)箱溫度為370C,CO:為5%,相對濕度為9801e.細(xì)胞單層貼壁生長,待長至80%左右備用(細(xì)胞發(fā)生融合時),用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1一2次,再用含0.25%胰酶的消化液消化2一3min,收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗_4.MTT法測定核桃揪提取液對SMMC-7721細(xì)胞增殖影響的檢測:將對數(shù)生長期的SMMC-7721腫瘤細(xì)胞,常規(guī)消化成1x10}/L的單細(xì)胞,以1x10;個/孔接種于%孔板中,每孔加人100閃,培養(yǎng)48h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗2次板,試藥按濃度遞增原則各設(shè)5個不同的濃度,最終質(zhì)量濃度分別為200.0、100.0,、50.0,、25.0,、12.5m擴L每種藥的每種濃度均設(shè)5個平行孔,陰性對照組為等容積的16.10培養(yǎng)基陽性討照組為X00m}-L}一Fn,在37U.5}7cC0,飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)24,36,48h后,然后每孔加入5郭LMTT20閃顯色,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,每孔加人150閃二甲基亞礬(DNISO),終止培養(yǎng),使用振蕩器,震蕩10min,使結(jié)屏物充分溶解,在酶標(biāo)儀490nm處測定各孔的吸光度(1)值.
5.統(tǒng)汁學(xué)分析:應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析計量資料均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗.
二、結(jié)果 結(jié)果表明,藥物作用24h后,對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強,200一12.5m郭L各劑量組抑制作用與陰性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Y<0.01),其中,200m舒I藥物對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最強,藥物作用48h后,藥物各劑量組的增殖抑制率與陰性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)其中,200m郭L藥物對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最強腫瘤生長的抑制顯示在一定范圍內(nèi)核桃揪皮與腫瘤細(xì)胞之間存在著量效和時效的關(guān)系(即200m歲i」核桃揪皮抑制腫瘤細(xì)胞的作用最強)三,、討論 MTT顯色法是當(dāng)前評價腫瘤細(xì)胞生存較實用的一種方法.實驗方法相對簡便,所用時間較短.當(dāng)腫瘤細(xì)胞在光鏡一「未出現(xiàn)明顯的外形變化時,其活細(xì)胞的線粒體內(nèi)唬拍酸脫氫酶能還原MTT而形成難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶的產(chǎn)物,但死細(xì)胞并沒有這個功能.用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其吸收值在一定數(shù)量的細(xì)胞范圍內(nèi),可以反映出活細(xì)胞的存活數(shù)量.MTT法對于臨床合理用藥,、實現(xiàn)腫瘤患者個體化治療具有重要價值.
我們在本研究中加人核桃揪皮提取物后對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的抑制作用,證實了核桃揪皮的抗癌作用通過不同濃度核桃揪皮的甲醇提取物進(jìn)行體外的抗腫瘤實驗,我們發(fā)現(xiàn)在12.5一200.0m郭L范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖的速度減慢,細(xì)胞存活率有所降低,即抗腫瘤活性隨濃度的增加和時間的延長而增強.
參考文獻(xiàn)
石建輝,王金輝,袁征. 核桃楸皮的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報,2006,(8):501-504.doi:10.3969/j.issn.1006-2858.2006.08.006.
周媛媛,王棟. 核桃楸不同藥理部位化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志,2007.8-10.
司傳領(lǐng),劉忠,惠嵐峰. 核桃揪樹皮提取物的化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2008.29-32.
田玉玲,李淑紅,劉冰. 胡桃楸水提物的遺傳毒性及抗誘變作用研究[J].檢測研究,2010.216-218.
管小玉,曲中原,鄒翔. 胡桃楸的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥,2009.35-37.
許紹惠,唐婉屏,韓忠環(huán). 核桃楸毒性成分研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1986.34-39.
Min BS,Lee SY,Kim JH. Anti-complement activity of constituents from the stem bark of Juglans mandshurica[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin,2003.1042-1044.
司傳領(lǐng),王丹,金辰奎. 核桃楸樹皮的沒食子酸、鞣花酸及水解單寧成分研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,(z1):8-10.doi:10.3321/j.issn:0253-2417.2007.z1.002.
一,、材料與方法
1,材料:RPMI1640粉末(Gihc.公司);M'I`T(Simga公司);二甲基亞颯(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);5一氟尿嚓u;}(5-Fu,江蘇恒瑞制藥有限公司,批號08031021);小牛lfJl清(杭州四季青);胰蛋白酶(Gibc.公司);十二水合磷酸氫二鈉(天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司);磷酸二氫鉀(沈陽市試劑廠);核桃揪樹皮(采自黑龍江省牡丹江牡丹江峰);SMMC-7721瘤株(牡丹江醫(yī)學(xué)院抗腫瘤研究所提供);酶標(biāo)白動分析儀(美國MolecularDevices).
2.核桃揪樹皮有效成分的提取:精密稱取核桃揪樹皮樣品5009,以乙醚回流48h,剩余物以甲醇回流48h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收甲醇轉(zhuǎn)水溶,過濾,濃縮,烘干,得到樣品.
3.細(xì)胞培養(yǎng):SMMC-7721細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)在含有10%新生牛血清和青霉素,、鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液中.培養(yǎng)箱溫度為370C,CO:為5%,相對濕度為9801e.細(xì)胞單層貼壁生長,待長至80%左右備用(細(xì)胞發(fā)生融合時),用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗1一2次,再用含0.25%胰酶的消化液消化2一3min,收集對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗_4.MTT法測定核桃揪提取液對SMMC-7721細(xì)胞增殖影響的檢測:將對數(shù)生長期的SMMC-7721腫瘤細(xì)胞,常規(guī)消化成1x10}/L的單細(xì)胞,以1x10;個/孔接種于%孔板中,每孔加人100閃,培養(yǎng)48h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗2次板,試藥按濃度遞增原則各設(shè)5個不同的濃度,最終質(zhì)量濃度分別為200.0、100.0,、50.0,、25.0,、12.5m擴L每種藥的每種濃度均設(shè)5個平行孔,陰性對照組為等容積的16.10培養(yǎng)基陽性討照組為X00m}-L}一Fn,在37U.5}7cC0,飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)條件下分別培養(yǎng)24,36,48h后,然后每孔加入5郭LMTT20閃顯色,繼續(xù)培養(yǎng)4h,吸棄培養(yǎng)液,每孔加人150閃二甲基亞礬(DNISO),終止培養(yǎng),使用振蕩器,震蕩10min,使結(jié)屏物充分溶解,在酶標(biāo)儀490nm處測定各孔的吸光度(1)值.
5.統(tǒng)汁學(xué)分析:應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件分析計量資料均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗.
二、結(jié)果 結(jié)果表明,藥物作用24h后,對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃度的增加而增強,200一12.5m郭L各劑量組抑制作用與陰性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Y<0.01),其中,200m舒I藥物對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最強,藥物作用48h后,藥物各劑量組的增殖抑制率與陰性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)其中,200m郭L藥物對SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最強腫瘤生長的抑制顯示在一定范圍內(nèi)核桃揪皮與腫瘤細(xì)胞之間存在著量效和時效的關(guān)系(即200m歲i」核桃揪皮抑制腫瘤細(xì)胞的作用最強)三,、討論 MTT顯色法是當(dāng)前評價腫瘤細(xì)胞生存較實用的一種方法.實驗方法相對簡便,所用時間較短.當(dāng)腫瘤細(xì)胞在光鏡一「未出現(xiàn)明顯的外形變化時,其活細(xì)胞的線粒體內(nèi)唬拍酸脫氫酶能還原MTT而形成難溶的藍(lán)紫色結(jié)晶的產(chǎn)物,但死細(xì)胞并沒有這個功能.用酶聯(lián)免疫檢測儀測定其吸收值在一定數(shù)量的細(xì)胞范圍內(nèi),可以反映出活細(xì)胞的存活數(shù)量.MTT法對于臨床合理用藥,、實現(xiàn)腫瘤患者個體化治療具有重要價值.
我們在本研究中加人核桃揪皮提取物后對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞具有明顯的抑制作用,證實了核桃揪皮的抗癌作用通過不同濃度核桃揪皮的甲醇提取物進(jìn)行體外的抗腫瘤實驗,我們發(fā)現(xiàn)在12.5一200.0m郭L范圍內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖的速度減慢,細(xì)胞存活率有所降低,即抗腫瘤活性隨濃度的增加和時間的延長而增強.
參考文獻(xiàn)
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周媛媛,王棟. 核桃楸不同藥理部位化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J].中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志,2007.8-10.
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管小玉,曲中原,鄒翔. 胡桃楸的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中草藥,2009.35-37.
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司傳領(lǐng),王丹,金辰奎. 核桃楸樹皮的沒食子酸、鞣花酸及水解單寧成分研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,(z1):8-10.doi:10.3321/j.issn:0253-2417.2007.z1.002.
