大量研究表明,無論是老年人群還是中青年人群,無論是患有心血管疾病人群還是健康人群,動脈僵硬度都能很好地預(yù)測冠心病、卒中等心腦血管事件,是心腦血管疾病獨立預(yù)測因子,已被歐洲高血壓指南列為常規(guī)檢測項目.年齡,、血壓水平和性別等重要影響因素只能部分解釋動脈僵硬度變異性,提示可能有遺傳的影響.
大量研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)影響血糖,、血脂代謝,并且有抗炎、抗增殖等作用,PPAR基因部分單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)位點不僅影響糖尿病的發(fā)生,、發(fā)展,還能直接影響動脈粥樣硬化的發(fā)生,、發(fā)展,但PPAR基因是否影響動脈僵硬度還未見報道.本研究旨在通過檢測PPAR及PPAR協(xié)同子等候選基因內(nèi)的部分SNP位點,觀察其與動脈僵硬度的關(guān)系.
資料與方法
1.對象:在2007年至2009年在北京地區(qū)進(jìn)行的旨在早期發(fā)現(xiàn)心血管疾病的流行病學(xué)調(diào)查人群基礎(chǔ)上[9],本研究篩選出完成了頸股段脈搏波傳導(dǎo)速度(carotid-femoralPWV,cfPWV)測定,并留取了血液樣本的50歲以上漢族居民1545例.惡性腫瘤、精神病等患者除外.所有參與者簽署知情同意書.
由于基因分型時所有位點均成功的有1374例,為便于同步分析心血管危險因素和遺傳因素對動脈僵硬度的影響,本研究舍去了171例分型不夠理想的參與者.
2.動脈僵硬度的測定:本研究使用法國Colson和LesLilas公司生產(chǎn)的Complior系統(tǒng),按照標(biāo)準(zhǔn)測量方法檢測受試者cfPWV,以cfPWV作為金標(biāo)準(zhǔn)判斷動脈僵硬度.按2007年歐洲高血壓防治指南,將cfPWV,12m/s定為動脈僵硬度增高組,共530例,其中女性275例(占51.9%);cfPWV<12m/s為動脈僵硬度正常組,共844例,其中女性511例(占60.5%).檢測時,檢測人員不知道被檢測人員心血管危險因素等情況.
3.主要試劑和儀器:TaqMan基因分型預(yù)混液(AppliedBiosystems公司,美國),基因分型探針(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司).ABI7900HT熒光實時定量PCR儀(AppliedBiosystems公司,美國).
4.DNA提取:按已建立的方法以Wizard⑧基因組DNA提取試劑盒(Promega公司,美國)從凍存的血凝塊內(nèi)提取全基因組DNA,純化,、定量后置于一70℃冰箱中保存?zhèn)溆?
5.引物設(shè)計與合成:根據(jù)基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點,利用SequenomMassARRAY)AssayDesign3.1軟件(Sequenom公司,美國)設(shè)計PCR特異性擴(kuò)增引物和探針序列,由上海基康生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)引物和探針設(shè)計,、合成(表1,2).
6.基因分型分析:向384孔板內(nèi)加人PCR擴(kuò)增體系及檢測探針使反應(yīng)物的終濃度如下:lxTaqMan基因分型預(yù)混液,各0.45mmol/L的PCR引物,0.25mmol/L的TaqManFam探針,0.25mmol/L的TaqManHex探針.總反應(yīng)體系為5.0閃.提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋至10ng/} 1,按設(shè)計順序每孔加2},1基因組DNAoPCR反應(yīng)條件為:50℃2min,95℃10min,然后95℃15s,60℃60s,循環(huán)40次.
7.統(tǒng)計學(xué)分析:正態(tài)分布計量資料用,.x士,、表示,組間比較用獨立樣本,檢驗;偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示,組間比較用Mann-Whitneyt7檢驗計數(shù)資料用例數(shù)和百分率表T,組間比較用f檢驗.SNP分析使用JAVA版單體型關(guān)聯(lián)研究測試(testinghaplotypeeffectsinassociationstudies,THESIAS)程序 THESIA程序源于隨機(jī)期望最大化(stochasticexpectation-maximization,SEM)算法,優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)EM算法;Hardy-Weinherg平衡以標(biāo)準(zhǔn)X}擬合度檢驗法計算’3其他數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析雙側(cè)檢驗,P<0.O5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.
結(jié)果
1.研究人群的一般特征:動脈僵硬度增高組(efPWV}12m/s)中有293例(55.30h)有高t(Il壓病史,115例(21.7%)有糖尿病史,女性275例(51.9%);而動脈僵硬度正常組有257例有高I(11壓病史(30.5),93例(11.0%)有糖尿病,女性511例(60.5%),兩組間在年齡、男性,、吸煙,、高血壓、糖尿病等心血,管危險因素上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3).
2.基因型頻率及Hardy-Weinherg平衡:PPARy協(xié)同子基因rs8192678,PPARB基因rs1053049,PPAI}.基因:s1800234等位l氛各自的等位基因頻率,、基因型頻率見表4ors8192678,rs1053049兩個位點在調(diào)杳人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡,但:s1800234不符合Hardy-Weinberg平衡.
3.SNP位點與動脈僵硬度的關(guān)系:PPARy協(xié)同子基(}Irs8192678,PPARB基因rs1053049,PPARa基因rsl800234等3個位點其基因型在動脈僵硬度止常和增高組中分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表5).
4.單體型的構(gòu)建與動脈僵硬度的關(guān)系:由PPARy協(xié)同子基因rs8192678,PPARB基ICIrs1053049,PPAR.基[}}]rs1800234組成的單體型與動脈f+}硬度無明確關(guān)系(表6).
討論
在本研究中僅發(fā)現(xiàn)年齡,、男性、吸煙,、高血壓,、糖尿病、同型半眺氨酸等心血管危險因素在動脈僵硬度增高組明顯聚集,并未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響和動脈粥樣硬化一樣,動脈僵硬度受多種因素的影響各種心血管危險因素可通過損傷血管內(nèi)皮導(dǎo)致動脈內(nèi)中膜鈣化斑塊形成,、彈力纖維減少,、膠原纖維增加、血管平滑肌增生和肥厚,從而一導(dǎo)致血管僵硬度增高但年齡,、血壓等傳統(tǒng)心血管危險因素只能部分解釋動脈僵硬度變異,提不動脈僵硬度可能還受遺傳因素影響,Tarnoki等〔is的研究也證實了這一點大量研究表明PPAR影響血糖,、血脂代謝,并且有抗炎、抗增殖等作用,因此我們推測PPAR基因可能對動脈僵硬度有影響.另有研究發(fā)現(xiàn)PPAR基因能直接影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,但PPAR基因是否影響動脈僵硬度未見報道在本研究中未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響.盡管如此,遺傳因素對動脈僵硬度有確切影響是不爭的事實,一二候選基因研究,、全基因組研究均發(fā)現(xiàn)位于腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng),、基質(zhì)金屬蛋白酶、內(nèi)皮素及與炎癥相關(guān)的基因上多個SNP位點與動脈僵硬度有密切關(guān)系[n7,較普遍的共識是遺傳因素對動脈僵硬度變異的影響為20%一60%.由于本研究是陰性結(jié)果,不能進(jìn)一步分析環(huán)境和遺傳因素對動脈僵硬度的交互作用.
本研究未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,其原因可能是多方面的.首先,所研究SNP位點可能并不是中國漢族人PPAR及PPAR協(xié)同子基因內(nèi)真正影響其功能的關(guān)鍵位點.本研究所選取的位點rs1800234位于PPAR.亞單位,在外顯子6上,由于CST變異導(dǎo)致227號密碼子處擷氨酸替代丙氨酸(V227A),為非同義變異,有較高的潛在研究價值.但是,多態(tài)性位點的功能機(jī)制很復(fù)雜,在不同人種間的分布有差別,同一基因內(nèi)功能性位點可能也有差別.有很多研究發(fā)現(xiàn)那些處于非編碼區(qū)的SNP反而與某種疾病有很緊密的聯(lián)系〔19],至今不能準(zhǔn)確闡明其機(jī)制.這些不確定性,導(dǎo)致研究候選基因時,特別是研究候選基因內(nèi)取較少的位點時,容易出現(xiàn)陰性結(jié)果.
其次,對心血管危險因素有影響的基因未必直接影響心血管疾病.動脈粥樣硬化性疾病被認(rèn)為是高血壓,、高脂血癥,、吸煙等各種危險因素導(dǎo)致的一種炎性疾病[20].但是,被寄予厚望的與炎癥因子相關(guān)的候選基因高敏C反應(yīng)蛋白基因,在大樣本,、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯恐幸仓话l(fā)現(xiàn)其僅對高敏C反應(yīng)蛋白濃度有影響,而對心血管疾病沒有直接的影響.一些針對動脈硬化的研究也發(fā)現(xiàn),部分參與動脈粥樣硬化的炎癥因子也參與了動脈硬化,但這些與炎癥因子相關(guān)的基因是否參與了動脈硬化還需要進(jìn)一步研究[23].
另外,雖然大量的流行病學(xué)研究提示遺傳因素在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用「24],但除2007年用全基因組篩查的方法發(fā)現(xiàn)的rs10757274,rs2383206,rs2383207,rs10757278等少數(shù)幾個SNP位點在十幾個國家得到了驗證匯,大部分基因研究的結(jié)果常不能被重復(fù)}.究其原因,既有單個研究結(jié)果的假陽(陰)性,或是真實的差異造成,更重要的是基因?qū)膊∫赘行杂绊懙膹?fù)雜性.單個研究的假陽(陰)性結(jié)果可能由單個研究的樣本量不足、人群分層,、基因型或表型的錯分以及不適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析方法等引起,而真實的差異多是由易感基因頻率不同,與疾病關(guān)聯(lián)特征不同,或是基因與環(huán)境間的復(fù)雜交互作用導(dǎo)致.
由于本研究為針對候選基因的研究,能選取的SNP位點數(shù)量有限,又沒有對PPAR及PPAR協(xié)同子進(jìn)行全基因序列檢測,勢必會漏掉一些SNP位點在這些沒有檢測的SNP位點中,是否有對動脈僵硬度有明顯影響的SNP位點,本研究不能回答.若使用全基因組測序的方法,可能會有陽性發(fā)現(xiàn),但所需經(jīng)費會明顯增加.另外,本研究為橫斷面研究,結(jié)論尚需臨床前瞻性研究進(jìn)一步證實.
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)動脈僵硬度增高組與正常組相比,心血管危險因素明顯增多,但并未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響.
大量研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)影響血糖,、血脂代謝,并且有抗炎、抗增殖等作用,PPAR基因部分單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)位點不僅影響糖尿病的發(fā)生,、發(fā)展,還能直接影響動脈粥樣硬化的發(fā)生,、發(fā)展,但PPAR基因是否影響動脈僵硬度還未見報道.本研究旨在通過檢測PPAR及PPAR協(xié)同子等候選基因內(nèi)的部分SNP位點,觀察其與動脈僵硬度的關(guān)系.
資料與方法
1.對象:在2007年至2009年在北京地區(qū)進(jìn)行的旨在早期發(fā)現(xiàn)心血管疾病的流行病學(xué)調(diào)查人群基礎(chǔ)上[9],本研究篩選出完成了頸股段脈搏波傳導(dǎo)速度(carotid-femoralPWV,cfPWV)測定,并留取了血液樣本的50歲以上漢族居民1545例.惡性腫瘤、精神病等患者除外.所有參與者簽署知情同意書.
由于基因分型時所有位點均成功的有1374例,為便于同步分析心血管危險因素和遺傳因素對動脈僵硬度的影響,本研究舍去了171例分型不夠理想的參與者.
2.動脈僵硬度的測定:本研究使用法國Colson和LesLilas公司生產(chǎn)的Complior系統(tǒng),按照標(biāo)準(zhǔn)測量方法檢測受試者cfPWV,以cfPWV作為金標(biāo)準(zhǔn)判斷動脈僵硬度.按2007年歐洲高血壓防治指南,將cfPWV,12m/s定為動脈僵硬度增高組,共530例,其中女性275例(占51.9%);cfPWV<12m/s為動脈僵硬度正常組,共844例,其中女性511例(占60.5%).檢測時,檢測人員不知道被檢測人員心血管危險因素等情況.
3.主要試劑和儀器:TaqMan基因分型預(yù)混液(AppliedBiosystems公司,美國),基因分型探針(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司).ABI7900HT熒光實時定量PCR儀(AppliedBiosystems公司,美國).
4.DNA提取:按已建立的方法以Wizard⑧基因組DNA提取試劑盒(Promega公司,美國)從凍存的血凝塊內(nèi)提取全基因組DNA,純化,、定量后置于一70℃冰箱中保存?zhèn)溆?
5.引物設(shè)計與合成:根據(jù)基因的目標(biāo)序列和所選擇的多態(tài)性位點,利用SequenomMassARRAY)AssayDesign3.1軟件(Sequenom公司,美國)設(shè)計PCR特異性擴(kuò)增引物和探針序列,由上海基康生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)引物和探針設(shè)計,、合成(表1,2).
6.基因分型分析:向384孔板內(nèi)加人PCR擴(kuò)增體系及檢測探針使反應(yīng)物的終濃度如下:lxTaqMan基因分型預(yù)混液,各0.45mmol/L的PCR引物,0.25mmol/L的TaqManFam探針,0.25mmol/L的TaqManHex探針.總反應(yīng)體系為5.0閃.提取純化后的基因組DNA樣品定量稀釋至10ng/} 1,按設(shè)計順序每孔加2},1基因組DNAoPCR反應(yīng)條件為:50℃2min,95℃10min,然后95℃15s,60℃60s,循環(huán)40次.
7.統(tǒng)計學(xué)分析:正態(tài)分布計量資料用,.x士,、表示,組間比較用獨立樣本,檢驗;偏態(tài)分布計量資料用中位數(shù)和四分位數(shù)表示,組間比較用Mann-Whitneyt7檢驗計數(shù)資料用例數(shù)和百分率表T,組間比較用f檢驗.SNP分析使用JAVA版單體型關(guān)聯(lián)研究測試(testinghaplotypeeffectsinassociationstudies,THESIAS)程序 THESIA程序源于隨機(jī)期望最大化(stochasticexpectation-maximization,SEM)算法,優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)EM算法;Hardy-Weinherg平衡以標(biāo)準(zhǔn)X}擬合度檢驗法計算’3其他數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析雙側(cè)檢驗,P<0.O5為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.
結(jié)果
1.研究人群的一般特征:動脈僵硬度增高組(efPWV}12m/s)中有293例(55.30h)有高t(Il壓病史,115例(21.7%)有糖尿病史,女性275例(51.9%);而動脈僵硬度正常組有257例有高I(11壓病史(30.5),93例(11.0%)有糖尿病,女性511例(60.5%),兩組間在年齡、男性,、吸煙,、高血壓、糖尿病等心血,管危險因素上差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3).
2.基因型頻率及Hardy-Weinherg平衡:PPARy協(xié)同子基因rs8192678,PPARB基因rs1053049,PPAI}.基因:s1800234等位l氛各自的等位基因頻率,、基因型頻率見表4ors8192678,rs1053049兩個位點在調(diào)杳人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡,但:s1800234不符合Hardy-Weinberg平衡.
3.SNP位點與動脈僵硬度的關(guān)系:PPARy協(xié)同子基(}Irs8192678,PPARB基因rs1053049,PPARa基因rsl800234等3個位點其基因型在動脈僵硬度止常和增高組中分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表5).
4.單體型的構(gòu)建與動脈僵硬度的關(guān)系:由PPARy協(xié)同子基因rs8192678,PPARB基ICIrs1053049,PPAR.基[}}]rs1800234組成的單體型與動脈f+}硬度無明確關(guān)系(表6).
討論
在本研究中僅發(fā)現(xiàn)年齡,、男性、吸煙,、高血壓,、糖尿病、同型半眺氨酸等心血管危險因素在動脈僵硬度增高組明顯聚集,并未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響和動脈粥樣硬化一樣,動脈僵硬度受多種因素的影響各種心血管危險因素可通過損傷血管內(nèi)皮導(dǎo)致動脈內(nèi)中膜鈣化斑塊形成,、彈力纖維減少,、膠原纖維增加、血管平滑肌增生和肥厚,從而一導(dǎo)致血管僵硬度增高但年齡,、血壓等傳統(tǒng)心血管危險因素只能部分解釋動脈僵硬度變異,提不動脈僵硬度可能還受遺傳因素影響,Tarnoki等〔is的研究也證實了這一點大量研究表明PPAR影響血糖,、血脂代謝,并且有抗炎、抗增殖等作用,因此我們推測PPAR基因可能對動脈僵硬度有影響.另有研究發(fā)現(xiàn)PPAR基因能直接影響動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,但PPAR基因是否影響動脈僵硬度未見報道在本研究中未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響.盡管如此,遺傳因素對動脈僵硬度有確切影響是不爭的事實,一二候選基因研究,、全基因組研究均發(fā)現(xiàn)位于腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng),、基質(zhì)金屬蛋白酶、內(nèi)皮素及與炎癥相關(guān)的基因上多個SNP位點與動脈僵硬度有密切關(guān)系[n7,較普遍的共識是遺傳因素對動脈僵硬度變異的影響為20%一60%.由于本研究是陰性結(jié)果,不能進(jìn)一步分析環(huán)境和遺傳因素對動脈僵硬度的交互作用.
本研究未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果,其原因可能是多方面的.首先,所研究SNP位點可能并不是中國漢族人PPAR及PPAR協(xié)同子基因內(nèi)真正影響其功能的關(guān)鍵位點.本研究所選取的位點rs1800234位于PPAR.亞單位,在外顯子6上,由于CST變異導(dǎo)致227號密碼子處擷氨酸替代丙氨酸(V227A),為非同義變異,有較高的潛在研究價值.但是,多態(tài)性位點的功能機(jī)制很復(fù)雜,在不同人種間的分布有差別,同一基因內(nèi)功能性位點可能也有差別.有很多研究發(fā)現(xiàn)那些處于非編碼區(qū)的SNP反而與某種疾病有很緊密的聯(lián)系〔19],至今不能準(zhǔn)確闡明其機(jī)制.這些不確定性,導(dǎo)致研究候選基因時,特別是研究候選基因內(nèi)取較少的位點時,容易出現(xiàn)陰性結(jié)果.
其次,對心血管危險因素有影響的基因未必直接影響心血管疾病.動脈粥樣硬化性疾病被認(rèn)為是高血壓,、高脂血癥,、吸煙等各種危險因素導(dǎo)致的一種炎性疾病[20].但是,被寄予厚望的與炎癥因子相關(guān)的候選基因高敏C反應(yīng)蛋白基因,在大樣本,、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯恐幸仓话l(fā)現(xiàn)其僅對高敏C反應(yīng)蛋白濃度有影響,而對心血管疾病沒有直接的影響.一些針對動脈硬化的研究也發(fā)現(xiàn),部分參與動脈粥樣硬化的炎癥因子也參與了動脈硬化,但這些與炎癥因子相關(guān)的基因是否參與了動脈硬化還需要進(jìn)一步研究[23].
另外,雖然大量的流行病學(xué)研究提示遺傳因素在心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的作用「24],但除2007年用全基因組篩查的方法發(fā)現(xiàn)的rs10757274,rs2383206,rs2383207,rs10757278等少數(shù)幾個SNP位點在十幾個國家得到了驗證匯,大部分基因研究的結(jié)果常不能被重復(fù)}.究其原因,既有單個研究結(jié)果的假陽(陰)性,或是真實的差異造成,更重要的是基因?qū)膊∫赘行杂绊懙膹?fù)雜性.單個研究的假陽(陰)性結(jié)果可能由單個研究的樣本量不足、人群分層,、基因型或表型的錯分以及不適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析方法等引起,而真實的差異多是由易感基因頻率不同,與疾病關(guān)聯(lián)特征不同,或是基因與環(huán)境間的復(fù)雜交互作用導(dǎo)致.
由于本研究為針對候選基因的研究,能選取的SNP位點數(shù)量有限,又沒有對PPAR及PPAR協(xié)同子進(jìn)行全基因序列檢測,勢必會漏掉一些SNP位點在這些沒有檢測的SNP位點中,是否有對動脈僵硬度有明顯影響的SNP位點,本研究不能回答.若使用全基因組測序的方法,可能會有陽性發(fā)現(xiàn),但所需經(jīng)費會明顯增加.另外,本研究為橫斷面研究,結(jié)論尚需臨床前瞻性研究進(jìn)一步證實.
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)動脈僵硬度增高組與正常組相比,心血管危險因素明顯增多,但并未發(fā)現(xiàn)PPAR及PPAR協(xié)同子基因上的SNP對動脈僵硬度有直接的影響.
