限制型心Hl1病(RCM)是以b室充盈受限和舒張功能障礙為特征的一類`b肌病,主要表現(xiàn)為心室舒張未升高和b房擴大,而心室大小,、室壁厚度和心室收縮功能大致正常與擴張型`b肌病(DCM)和肥厚型`b肌病(HCM)相比,RCM發(fā)病率較低,在兒童`b肌病中僅占3%~5%,但其預(yù)后較差,確診后平均生存周期僅為2年"由于原發(fā)性RCM發(fā)病率低,相關(guān)研究不多.發(fā)病機制H前仍不清楚,原發(fā)性RCM患者巾30%呈家族性,提示遺傳因素是其亙要病岡:自2003年第l次報道在RCM患者中發(fā)現(xiàn)TNNI3基岡突變3以來,已發(fā)現(xiàn)了8個肌節(jié)蛋白基閃突變與RCM有關(guān)3^,以TNN",、TNNI3,、M,、H7,、ACTC皋丨村突變?yōu)橹?提示肌節(jié)蛋白基因突變是原發(fā)性RCM的重要遺傳基礎(chǔ).岡此,在排除了炎癥浸潤,、糖原代謝病,、彈力纖維增生癥、淀粉樣變性等繼發(fā)性疾病后,對原發(fā)性RCM患者開展肌節(jié)蛋白基岡突變篩查,對揭示RCM的發(fā)病機制具有重要意義Ⅱ本研究對確診的3例原發(fā)性兒童RCM的臨床特征進行總結(jié)分析,并進行肌節(jié)蛋白基因突變篩查,以期發(fā)現(xiàn)RCM發(fā)病的分子基礎(chǔ).
資料與方法
1研究對象:共收集了3例RCM先證者及其家族成員資料,其中病例1和病例2來自加拿大醫(yī)院心臟中心,病例3來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院心臟科c先證者均接受心電圖,、超聲`b動圖,、心臟核磁共振成像(MRI)和(或)心導(dǎo)管及各項實驗室檢查,排除染色體異常、骨骼系統(tǒng),、糖原累積癥,、彈力纖維增生癥及淀粉樣變性等疾病.所有患兒的父母及同胞均經(jīng)超聲b電圖,、心電圖等排除心臟疾病:RCM超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)"°:左、右心房增大,心室壁正?；蜉p度肥厚,心室內(nèi)徑正常;左b室舒張功能障礙,收縮功能正常;多普勒提示左`b室限制型mL流頻譜:脈沖多普勒測量二尖瓣口lll流頻譜E峰及A峰的峰值速度E/A比值≥2,E峰斜率時問(DT)縮短(≤150ms),左`b室等容舒張期縮短(≤70ms)另選擇于我院門診體檢的10O名健康兒童為正常對照,其中男,、女各50名.
本研究獲得患兒所在醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn),所有研究對象或監(jiān)護人均獲知情同意i2.患兒`b肌組織病理檢查:經(jīng)知情同意,分別對病例l和病例2行經(jīng)`b導(dǎo)管心內(nèi)膜心肌活檢c采用標(biāo)準(zhǔn)實驗方法.對活檢心肌組織分別進行常規(guī)組織學(xué)染色干Π投射電鏡檢查「3肌節(jié)蛋白基岡突變篩查:采集研究對象外周雨L提取基囚組DNA使用phme3軟件對TNNT2、TNNB,、ACTC,、MYH7基岡所有編碼序列及內(nèi)含子一外顯子拼接部位設(shè)計引物.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增RCM患兒目的基岡片段并純化,直接雙向測序,通過對照基囚測序圖譜、DHPLC檢測結(jié)果以及與GenBank序列比對確定突變位點,使用Muhahn在線軟件對比分析突變氨基酸的保守性.如發(fā)現(xiàn)突變,進一步檢測該突變在家族成員及正常對照兒童的分布情況:
結(jié)果
1.患兒臨床特征分析結(jié)果:病例1,為一名12歲女孩,患兒出生后即囚心臟雜音就診發(fā)現(xiàn)膜部室間隔缺損(缺損大小約2mm),隨訪18個月除發(fā)現(xiàn)室間隔缺損持續(xù)存在,、左心室稍大外,新發(fā)現(xiàn)左,、右心房增大,肺靜脈內(nèi)異常反流,左心室收縮功能正常而舒張功能障礙.患兒于3歲時接受`b導(dǎo)管檢查顯示左`b室舒張期壓力達16mmHg(lmmHg=0133kPa),右`b室壓力達左心室壓力的50%.心臟MRI進一步排除`b包異常及心肌肥厚.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢及其他各項檢查后,患兒被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔缺損.患兒于8歲時漸出現(xiàn)勞力性呼吸困難,心電圖提示P波增高增寬,下壁導(dǎo)聯(lián)ST段下移;超聲心電圖顯示左心房進一步增大,呈限制型血流頻譜,左心室舒張功能嚴(yán)重受損(圖1a).再次心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn)左心室舒張期壓力升高至"23mmHg.后患兒服用阿替洛爾,但癥狀仍進行性加重,目前紐約心功能分級(NYHA分級)Ⅲ級,等待心臟移植.病例2,女孩,既往體健,11歲時因勞力性呼吸困難就診,心電圖顯示竇性心律,左心房增大,心室肥厚,廣泛的T波改變.超聲心動圖示左心房顯著增大,左心室舒張期內(nèi)徑和收縮功能正常,室間隔輕度肥厚,無心室局部反向運動,無左心室流出道梗阻,左心室舒張功能嚴(yán)重受損,呈典型的限制型血流頻譜——左心房血流充盈速麂減低(0.笏m/s,正常>0.5m/s),DT縮短(1"ms,正常>150ms),E/A比值升高(E/A=2.32,正常<2),ⅣRT明顯縮短(25ms,正常)TOms).心臟MRI進一步證實左心房顯著增大,心室內(nèi)徑正常,室間隔中下段輕度肥厚(約為15mm),并排除心包疾病.
改良Bmce運動試驗中出現(xiàn)胸痛和廣泛顯著的sT段下移.心導(dǎo)管檢查提示患兒心臟指數(shù)正常,左、右心室舒張期壓力顯著升高.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢等各項檢測,排除相關(guān)繼發(fā)因素后,患者被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔中下段輕度肥厚.患兒接受了口服美托洛爾(2mg·kg·d)和阿司匹林(80mg,每日3次)治療,但病情仍進行性加重,氣促明顯并頻繁胸痛(NYHA分級Ⅲ級).患兒最終于首診后15個月接受了心臟移植,目前已隨訪4年,一般情況良好.
病例3,為一名I1歲女孩,既往體健.患兒10歲時因活動后氣促,、胸悶就診,超聲心動圖發(fā)現(xiàn)左,、右心房明顯增大,心室內(nèi)徑及室壁厚度正常,左心室收縮功能正常,左心室舒張功能下降;彩色多普勒示限制型血流頻譜.心臟MRI進一步證實上述改變,并排除心包異常.心電圖顯示竇性心律,雙心房增大,廣泛的T波改變.患兒氣促漸加重,出現(xiàn)全身水腫,后予地高辛、卡托普利及利尿劑等口服,水腫好轉(zhuǎn),目前已隨訪1年余,仍活動受限,YHA分級Ⅱ級.2,患兒組織學(xué)檢查結(jié)果:組織學(xué)檢查提示病例1存在廣泛的心肌細胞排列紊亂和纖維化,電鏡顯示肌節(jié)數(shù)量減少,線粒體顯著增大變形(圖2).病例2`心肌細胞輕度肥厚和間質(zhì)纖維化,進一步透射電鏡檢查顯示Z線排列紊亂,間距不規(guī)貝刂(圖3).
3.遺傳學(xué)檢測結(jié)果:對病例1檢測發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子α611G>A雜合突變造成第204位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸("04H),該突變在HCM及RCM患者中均被報道過(圖1b).在病例2中發(fā)現(xiàn)了TNN"基因第9外顯子⒍"7-302AATGAG雜合缺失突變,造成第100,、101號氨基酸缺J走(p.Asn100~αu101del,100~101delNE),該突變目前尚未被報道(圖4a).在病例3中發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子⒍575G>A雜合突變造成第192位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R192H),該突變在RCM和HCM患者中均被報道過(圖1b).蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),所有突變所處氨基酸在多個物種高度保守(圖lb,、圖4b).所有突變只在病例本人中出現(xiàn),而在其父母及正常對照兒童中均未檢測到.除上述突變外,未發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的其他候選基因突變.
討論
心肌肌節(jié)蛋白基因突變是HCM和DCM發(fā)病的重要遺傳基礎(chǔ),目前至少已發(fā)現(xiàn)13個致病基因,與DCM有關(guān)的突變位點約20多個;而與HCM有關(guān)的突變位點達200多個["45],其中超過SO%集中在MYBPC3、MYH7,、TNNI3,、TNNI,、TPM1基因.由于RCM發(fā)病率低,且多為散發(fā),目前研究報道不多.自2003年Mogensen等[3]通過對家族性RCM連鎖分析首次發(fā)現(xiàn)TNNI3基因突變以來,已發(fā)現(xiàn)了8個肌節(jié)蛋白基因3化圖維突變,主要分布在TNN",、TNNI3、MYH7,、ACTC等基因.
資料與方法
1研究對象:共收集了3例RCM先證者及其家族成員資料,其中病例1和病例2來自加拿大醫(yī)院心臟中心,病例3來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院心臟科c先證者均接受心電圖,、超聲`b動圖,、心臟核磁共振成像(MRI)和(或)心導(dǎo)管及各項實驗室檢查,排除染色體異常、骨骼系統(tǒng),、糖原累積癥,、彈力纖維增生癥及淀粉樣變性等疾病.所有患兒的父母及同胞均經(jīng)超聲b電圖,、心電圖等排除心臟疾病:RCM超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)"°:左、右心房增大,心室壁正?；蜉p度肥厚,心室內(nèi)徑正常;左b室舒張功能障礙,收縮功能正常;多普勒提示左`b室限制型mL流頻譜:脈沖多普勒測量二尖瓣口lll流頻譜E峰及A峰的峰值速度E/A比值≥2,E峰斜率時問(DT)縮短(≤150ms),左`b室等容舒張期縮短(≤70ms)另選擇于我院門診體檢的10O名健康兒童為正常對照,其中男,、女各50名.
本研究獲得患兒所在醫(yī)院道德倫理委員會批準(zhǔn),所有研究對象或監(jiān)護人均獲知情同意i2.患兒`b肌組織病理檢查:經(jīng)知情同意,分別對病例l和病例2行經(jīng)`b導(dǎo)管心內(nèi)膜心肌活檢c采用標(biāo)準(zhǔn)實驗方法.對活檢心肌組織分別進行常規(guī)組織學(xué)染色干Π投射電鏡檢查「3肌節(jié)蛋白基岡突變篩查:采集研究對象外周雨L提取基囚組DNA使用phme3軟件對TNNT2、TNNB,、ACTC,、MYH7基岡所有編碼序列及內(nèi)含子一外顯子拼接部位設(shè)計引物.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增RCM患兒目的基岡片段并純化,直接雙向測序,通過對照基囚測序圖譜、DHPLC檢測結(jié)果以及與GenBank序列比對確定突變位點,使用Muhahn在線軟件對比分析突變氨基酸的保守性.如發(fā)現(xiàn)突變,進一步檢測該突變在家族成員及正常對照兒童的分布情況:
結(jié)果
1.患兒臨床特征分析結(jié)果:病例1,為一名12歲女孩,患兒出生后即囚心臟雜音就診發(fā)現(xiàn)膜部室間隔缺損(缺損大小約2mm),隨訪18個月除發(fā)現(xiàn)室間隔缺損持續(xù)存在,、左心室稍大外,新發(fā)現(xiàn)左,、右心房增大,肺靜脈內(nèi)異常反流,左心室收縮功能正常而舒張功能障礙.患兒于3歲時接受`b導(dǎo)管檢查顯示左`b室舒張期壓力達16mmHg(lmmHg=0133kPa),右`b室壓力達左心室壓力的50%.心臟MRI進一步排除`b包異常及心肌肥厚.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢及其他各項檢查后,患兒被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔缺損.患兒于8歲時漸出現(xiàn)勞力性呼吸困難,心電圖提示P波增高增寬,下壁導(dǎo)聯(lián)ST段下移;超聲心電圖顯示左心房進一步增大,呈限制型血流頻譜,左心室舒張功能嚴(yán)重受損(圖1a).再次心導(dǎo)管檢查發(fā)現(xiàn)左心室舒張期壓力升高至"23mmHg.后患兒服用阿替洛爾,但癥狀仍進行性加重,目前紐約心功能分級(NYHA分級)Ⅲ級,等待心臟移植.病例2,女孩,既往體健,11歲時因勞力性呼吸困難就診,心電圖顯示竇性心律,左心房增大,心室肥厚,廣泛的T波改變.超聲心動圖示左心房顯著增大,左心室舒張期內(nèi)徑和收縮功能正常,室間隔輕度肥厚,無心室局部反向運動,無左心室流出道梗阻,左心室舒張功能嚴(yán)重受損,呈典型的限制型血流頻譜——左心房血流充盈速麂減低(0.笏m/s,正常>0.5m/s),DT縮短(1"ms,正常>150ms),E/A比值升高(E/A=2.32,正常<2),ⅣRT明顯縮短(25ms,正常)TOms).心臟MRI進一步證實左心房顯著增大,心室內(nèi)徑正常,室間隔中下段輕度肥厚(約為15mm),并排除心包疾病.
改良Bmce運動試驗中出現(xiàn)胸痛和廣泛顯著的sT段下移.心導(dǎo)管檢查提示患兒心臟指數(shù)正常,左、右心室舒張期壓力顯著升高.經(jīng)心內(nèi)膜心肌活檢等各項檢測,排除相關(guān)繼發(fā)因素后,患者被診斷為原發(fā)性RCM合并室間隔中下段輕度肥厚.患兒接受了口服美托洛爾(2mg·kg·d)和阿司匹林(80mg,每日3次)治療,但病情仍進行性加重,氣促明顯并頻繁胸痛(NYHA分級Ⅲ級).患兒最終于首診后15個月接受了心臟移植,目前已隨訪4年,一般情況良好.
病例3,為一名I1歲女孩,既往體健.患兒10歲時因活動后氣促,、胸悶就診,超聲心動圖發(fā)現(xiàn)左,、右心房明顯增大,心室內(nèi)徑及室壁厚度正常,左心室收縮功能正常,左心室舒張功能下降;彩色多普勒示限制型血流頻譜.心臟MRI進一步證實上述改變,并排除心包異常.心電圖顯示竇性心律,雙心房增大,廣泛的T波改變.患兒氣促漸加重,出現(xiàn)全身水腫,后予地高辛、卡托普利及利尿劑等口服,水腫好轉(zhuǎn),目前已隨訪1年余,仍活動受限,YHA分級Ⅱ級.2,患兒組織學(xué)檢查結(jié)果:組織學(xué)檢查提示病例1存在廣泛的心肌細胞排列紊亂和纖維化,電鏡顯示肌節(jié)數(shù)量減少,線粒體顯著增大變形(圖2).病例2`心肌細胞輕度肥厚和間質(zhì)纖維化,進一步透射電鏡檢查顯示Z線排列紊亂,間距不規(guī)貝刂(圖3).
3.遺傳學(xué)檢測結(jié)果:對病例1檢測發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子α611G>A雜合突變造成第204位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸("04H),該突變在HCM及RCM患者中均被報道過(圖1b).在病例2中發(fā)現(xiàn)了TNN"基因第9外顯子⒍"7-302AATGAG雜合缺失突變,造成第100,、101號氨基酸缺J走(p.Asn100~αu101del,100~101delNE),該突變目前尚未被報道(圖4a).在病例3中發(fā)現(xiàn)了TNNI3基因第8外顯子⒍575G>A雜合突變造成第192位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R192H),該突變在RCM和HCM患者中均被報道過(圖1b).蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),所有突變所處氨基酸在多個物種高度保守(圖lb,、圖4b).所有突變只在病例本人中出現(xiàn),而在其父母及正常對照兒童中均未檢測到.除上述突變外,未發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的其他候選基因突變.
討論
心肌肌節(jié)蛋白基因突變是HCM和DCM發(fā)病的重要遺傳基礎(chǔ),目前至少已發(fā)現(xiàn)13個致病基因,與DCM有關(guān)的突變位點約20多個;而與HCM有關(guān)的突變位點達200多個["45],其中超過SO%集中在MYBPC3、MYH7,、TNNI3,、TNNI,、TPM1基因.由于RCM發(fā)病率低,且多為散發(fā),目前研究報道不多.自2003年Mogensen等[3]通過對家族性RCM連鎖分析首次發(fā)現(xiàn)TNNI3基因突變以來,已發(fā)現(xiàn)了8個肌節(jié)蛋白基因3化圖維突變,主要分布在TNN",、TNNI3、MYH7,、ACTC等基因.
