全球半數(shù)以上人口感染幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori),，我國人群H.pylori感染率為56.22%,。H.pylori感染不僅與胃炎,、消化性潰瘍,、胃癌等疾病密切相關(guān),，而且與多種胃腸道外疾病相關(guān)，1994年已被WHO列為一級致癌原,。三聯(lián)療法為國內(nèi)外推薦的一線治療方案,，其根除率正逐年下降，在某些地區(qū)已低于70%,，遠(yuǎn)低于感染性疾病80%的起始治愈率,。日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥是根除率下降的最主要原因。本文采用藥敏實(shí)驗(yàn)法和PCR產(chǎn)物測序法對26株H.pylori臨床分離株進(jìn)行了克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥檢測,，以探討H.pylori耐藥和基因突變的關(guān)系,。
材料與方法
1 樣本杭州致遠(yuǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所提供的26株幽門螺桿菌臨床分離株。
2 藥敏實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)H.pylor;菌株,，采用E-test法測定H.pylori對克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration,MIC),。耐藥判定標(biāo)準(zhǔn):克拉霉素MIL>1ug/ml，左氧氟沙星MIL>1ug/m1,。
3 PCR測序法
3.1 用深圳市普瑞康生物技術(shù)有限公司DNA提取液與菌液11等體積混合,，100空氣浴10min;4、冷卻30min,13000r/min離心5min,，取上清轉(zhuǎn)移至新離心管,，-20℃凍存。3.223SrRNA和gyrA基因片段擴(kuò)增及測序:參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)上下游引物,。PCR反應(yīng)體系50ul:DNA模板5ul,500nmol/L上下游引物,，1UrTaq酶，200umol/LdNTP,，1XPCRbuffer,，ddH2O29ul。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,52C,、退火30s,72℃,、延伸30s循環(huán)35次，72℃延伸5min,。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,，使用TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,，按說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化后，送北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序,。測序結(jié)果用Vec-forNTIsuite7.1軟件與H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株26695序列進(jìn)行比對,。
結(jié)果
1 H.pylori藥敏實(shí)驗(yàn)檢測26例H.pylori臨床分離株中，6例對克拉霉素耐藥,，6例對左氧氟沙星耐藥,，8例對克拉霉素和左氧氟沙星雙重耐藥，剩余6例為敏感菌株,。
2 克拉霉素耐藥株在23SrRNA基因的突變和左氧氟沙星耐藥株在gyrA基因的突變26例H.py-lori臨床分離株經(jīng)PCR均擴(kuò)增出23SrRNA基因中含克拉霉素耐藥決定區(qū)的目的片段,。測序結(jié)果顯示14例克拉霉素耐藥菌株的23SrRNA基因發(fā)生點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)為2143(A2143U)(表2)026例H.pylori臨床分離株經(jīng)PLR均擴(kuò)增出gyrA基因中含哇諾酮類耐藥決定區(qū)(quinolone-resistance-deter-miningregion,QRDR)的目的片段,。測序結(jié)果顯示14例左氧氟沙星耐藥菌株的gyrA基因發(fā)生突變,，突變位置是第87和91位氨基酸。
討論
1982年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall首次從人體胃組織中分離出一種彎曲螺旋狀革蘭陰性桿菌,，稱為幽門螺桿菌,。目前公認(rèn)H.pylori感染與多種胃部疾病相關(guān)。由于治療的不規(guī)范和抗生素耐藥,，尤其是對甲硝哇,、克拉霉素等的耐藥，三聯(lián)療法對H.pylori的根除率正逐年下降,。MaastrichtN指出克拉霉素耐藥為標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)根除率下降的最主要因素,。左氧氟沙星常作為克拉霉素高耐藥的替代藥物。研究發(fā)現(xiàn)在中國H.pylori對克拉霉素的原始耐藥率已達(dá)37.200,，繼發(fā)耐藥率更高,，喹諾酮類藥物的耐藥率為25%。
此前研究表明,，23SrRNA基因發(fā)生突變是導(dǎo)致H.pylori對克拉霉素耐藥的主要原因,，23crRNA基因突變位點(diǎn)有A21420,A2112G,A2143U,A2146C,A2147G，A2223G等;gyrA基因突變是導(dǎo)致H.pylori對喳諾酮類耐藥的主要原因,，突變主要發(fā)生在第87和91位氨基酸,。本研究26例H.pylori臨床分離株中，14例克拉毒素耐藥菌株均為A2143(i突變,，未發(fā)現(xiàn)其他基因位點(diǎn)突變;14例左氧氟沙星耐藥菌株中,，9例菌株是第87位氨基酸突變，5例是第91位氨基酸突變,。表明浙江地區(qū)H.pylori對克拉霉素耐藥菌株基因突變主要為A2143G,，對左氧氟沙星耐藥菌株基因突變主要發(fā)生在gyrA基因的第87和91位氨基酸。
根據(jù)H.pylori耐藥情況來指導(dǎo)臨床用藥，對患者進(jìn)行個體化治療,，能有效提高根除率,。細(xì)菌培養(yǎng)是H.pylori感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥,，但該方法復(fù)雜,、耗時，培養(yǎng)條件苛刻,，敏感度低,。近些年來用于檢測耐藥基因突變的分子生物學(xué)檢測方法快速發(fā)展，具有快速,、敏感等優(yōu)點(diǎn),，是根除H.pylori個體化治療的發(fā)展方向,，個體化治療是應(yīng)對日益嚴(yán)重的耐藥情況并根除H.pylori感染的發(fā)展方向,，而基因型耐藥檢測方法的準(zhǔn)確性有賴于更廣泛的臨床驗(yàn)證。
