微生物學(xué)報(bào)  4 May 2009, 49(5):591-596

含蘇氨酸操縱子重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其對大腸桿菌L-蘇氨酸積累的影響

張雪1,2 ,，閆繼愛1,2 ,，于雷2 ,，張國強(qiáng)2 ,，張蕓2 ,，陳寧1 ,，溫廷益2

1天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,，天津 300457

2中國科學(xué)院微生物研究所,，北京 100101

摘要：【目的】通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建重組質(zhì)粒,，將其轉(zhuǎn)入野生型大腸桿菌W3110，分析含蘇氨酸操縱子基因的質(zhì)粒及質(zhì)粒定點(diǎn)突變解除反饋抑制時(shí),，對 L-蘇氨酸積累的影響,。【方法】以 W3110染色體DNA為模板,，PCR擴(kuò)增蘇氨酸操縱子基因,，即啟動(dòng)子THrLp 、編碼前導(dǎo)肽基因thrL以及thrA ,、thrB ,、thrC 基因，通過重疊延伸PCR的方法對thrA 基因定點(diǎn)突變,，解除蘇氨酸對它的反饋抑制,，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pWYE112 和pWYE134,5L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)測定L- 蘇氨酸的產(chǎn)量?！窘Y(jié)果】經(jīng) 5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn),，W3110 的L-蘇氨酸產(chǎn)量為0.036±0.004g/L，攜帶含蘇氨酸操縱子質(zhì)粒的W3110 菌株L-蘇氨酸產(chǎn)量為2.590±0.115g/L ,，質(zhì)粒上thrA解除反饋抑制后,，L- 蘇氨酸的產(chǎn)量增加到9.223±1.279g/L ,。【結(jié)論】過表達(dá)蘇氨酸操縱子基因可以使 L-蘇氨酸積累,，進(jìn)一步解除thrA 基因的反饋抑制,，可以增強(qiáng)L- 蘇氨酸積累的效果，為L- 蘇氨酸工程菌改造的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ),。

關(guān)鍵詞：L-蘇氨酸,；重疊延伸PCR ；大腸桿菌,；發(fā)酵,；定點(diǎn)突變

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