雙向電泳IPG
一,、樣品提取：三氯醋酸—丙酮沉淀法
（1） 在液氮中研磨葉片
（2） 加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,，然后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）棄上清,。
（3） 加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后離心（4℃8000rpm以上1小時(shí)）,，然后真空干燥沉淀,，備用。
（4） 上樣前加入裂解液,，室溫放置30分鐘,，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心（15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)）,，可臨時(shí)保存在4℃待用,。
（5） 用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?/p>
二,、一向電泳（13cm的holder）
（1） 取大約70-100ng的蛋白與溶脹液混合總體積達(dá)到250vl
（2） 將上述溶液加到holder的兩個(gè)電極之間,。
（3） 去掉膠條的保護(hù)膜，膠面朝下，先將膠條尖端朝膠條槽的尖端方向放入膠條槽中,，慢慢下壓膠條,，并前后移動(dòng)，避免生成氣泡,，最后放下膠條平端,，使溶液浸濕整個(gè)膠條。
（4） 在膠條上覆蓋適量的覆蓋油,，蓋上蓋子,。
（5） 將膠條槽平放于一向儀器上，與水平方向垂直,。
（6） 設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù)：
三,、膠條的平衡（由一向到二向）
（1） 將膠條放入10ml平衡緩沖液中（加入10mgDTT）封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘,。
（2） 將膠條取出放入10ml新的平衡緩沖液中（加入250mg的碘乙酰胺）封口,，在振蕩儀上振蕩15分鐘。
（3） 用去離子水潤(rùn)洗膠條一秒鐘,，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘,，以去除多余的平衡緩沖液。
四,、二向電泳
（1） 將平衡好的膠條直接轉(zhuǎn)移到第二向制好的SDS膠上,，然后用瓊脂糖封頂，準(zhǔn)備第二向電泳.
（2） 設(shè)置儀器的運(yùn)行參數(shù)：
五,、平板膠的染色
硝酸銀染色：（整個(gè)操作在搖床上進(jìn)行）
（1） 固定：25ml的冰醋酸,，100ml甲醇，125ml去離子水,，60分鐘,。
（2） 敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸鈉（使用之前加入）,，17g醋酸鈉,，165ml去離子水，30分鐘,。
（3） 清洗：用250ml的去離子水清洗3次每次5分鐘,。
（4） 銀染：0.625g硝酸銀，250去離子水,，（使用之前配制）20分鐘。
（5） 顯色：6.25g碳酸鈉,，100vl的甲醛（使用之前加入）,，250ml去離子水。
（6） 終止：5%的醋酸,。
（7） 照相分析,。
（8） 保存制作干膠,。
藥品：
提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml,。
平衡緩沖液：1.5MTris－Cl ph8.8 6.7ml,，尿素72.07g ，87％的甘油69ml,，SDS 4g,，溴酚藍(lán)少許。
溶漲液：尿素12g,，CHAPS0.5g,，溴酚藍(lán)少許溶于無菌水中，總體積為25ml,。使用之前再加入IPG緩沖液0.5vl/100vl,，DTT1.5vl/100vl。
制作平板膠：
分離膠的配制方法：
藥品/濃度
5％
7.5％
10％
12.5%
15%
丙烯酰胺
6.7ml
10ml
13.3ml
16.7ml
20ml
分離膠緩沖液
10ml
10ml
10ml
10ml
10ml
10×SDS
0.4ml
0.4ml
0.4ml
0.4ml
0.4ml
無菌水
22.7ml
19.4ml
16.1ml
12.8ml
9.5ml
10％過硫酸胺*
200vl
200vl
200vl
200vl
200vl
TEMED*
13.3vl
13.3vl
13.3vl
13.3vl
13.3vl
*在灌膠之前加入
藥品配制：
丙烯酰胺單體儲(chǔ)液：丙烯酰胺60g甲叉雙丙烯酰胺1.6g溶于無菌水中總體積200ml
分離膠緩沖液：Trisbase181.5g溶于750ml無菌水中調(diào)PH8.8總體積1000ml
10％SDS：SDS5g溶于無菌水中總體積50ml
10％的過硫酸胺：0.1g溶于無菌水中總體積1ml
SDS電泳緩沖液：Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于無菌水中總體積5000ml
封膠溶液：SDS電泳緩沖液100ml瓊脂糖0.5g溴酚藍(lán)少許
附：蛋白質(zhì)含量測(cè)定的方法（Bradford方法）
原理：這一方法基于2考馬斯亮藍(lán)G－250有紅藍(lán)兩種不同的形式,。在一定濃度的乙醇及酸性條件下,，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后,，產(chǎn)生藍(lán)色化合物,，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng)化合物在465－595nm處有最大的光吸收值,，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系,，因此可檢測(cè)595nm的光吸收值的大小計(jì)算蛋白的含量。
溶液：
1）Bradford儲(chǔ)存液
100ml95％乙醇
200ml88％磷酸
350mgServaG藍(lán)
室溫下長(zhǎng)期保持穩(wěn)定,。
2）Bradford工作液
425ml雙蒸水
15ml95％乙醇
30ml88％磷酸
30ml Bradford儲(chǔ)存液
用濾紙過濾,，保存于室溫棕色瓶中，可保存數(shù)周,，但在使用前需要過濾,。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）
做標(biāo)準(zhǔn)曲線：
樣品號(hào)
蛋白量
/vg
標(biāo)準(zhǔn)溶液
1mg/mlBSA/vl
實(shí)驗(yàn)緩沖液
/vl
Bradford試劑/ml
A595
1
0
0
100
3
0
2
2.5
2.5
97.5
3
0.120
3
2.5
2.5
97.5
3
0.130
4
5
5
95
3
0.250
5
5
5
95
3
0.215
6
7.5
7.5
92.5
3
0.331
7
7.5
7.5
92.5
3
0.364
8
10
10
90
3
0.460
9
10
10
90
3
0.442
10
12.5
12.5
87.5
3
0.531
11
12.5
12.5
87.5
3
0.562
12
15
15
85
3
0.633
13
15
15
85
3
0.617
14
17.5
17.5
82.5
3
0.684
15
17.5
17.5
82.5
3
0.650
16
20
20
80
3
0.721
17
20
20
80
3
0.727
取樣品即可測(cè)量。
注意事項(xiàng)：
1,、樣品的問題：
樣品制備是做好2-d的關(guān)鍵,，這句話好象有點(diǎn)多余，如果樣品中離子濃度過大,，根本做不了2d,，我開始的時(shí)候由于提取方法有問題，結(jié)果浪費(fèi)了很多時(shí)間和IPG膠條,，真的很心痛呀,！另外再說明一點(diǎn)，最好用新鮮的樣品提取蛋白質(zhì)，蛋白點(diǎn)的差異很大,，新鮮的樣品點(diǎn)多,，而我用存放在-80的樣品跑出來效果差了很多呀！如果你不確定你的蛋白提的如何,，建議你先跑sds-page,。檢驗(yàn)一下。關(guān)于蛋白的提取方法,，我還想聽聽各位的建議,。
2、上樣量的問題,，我覺得我跑的這張2D圖,，上樣量還需要調(diào)整，可以適當(dāng)降低,，我的ipg膠條是13厘米的上樣量在50ng-80ng之間,，上樣量不合適，豐度低的將會(huì)被豐度高的所遮蓋,，這是最討厭的問題,。
3、跑一向的時(shí)候大家都差不多,，根據(jù)公司的說明就可以做了,。跑二向的時(shí)候我現(xiàn)在一般做恒壓，以前做過恒流,，沒感覺有什么差異,，還想請(qǐng)教各位！橫流和恒壓到底哪個(gè)更好一些,！
4,、ipg膠條ph的選擇，我做的是植物的花藥,，一般情況下酸性端點(diǎn)多一點(diǎn),，堿性端較少，我現(xiàn)在選用的是ph3-10的,，我覺得很不合適,，（不過這個(gè)膠條是免費(fèi)的）因此好多點(diǎn)沒能很好的分開，如果膠條的ph小一點(diǎn),，膠條（我希望能達(dá)到18cm）可是我們這里做不了,，效果應(yīng)該比這個(gè)好很多的！
5,、從這塊膠上,，我覺得致命點(diǎn)就是背景深,，將影響我下一步的分析。所以銀染還需要改進(jìn),！
6、針對(duì)不同的蛋白質(zhì),，分離膠的濃度也是可以調(diào)節(jié)的,，我比較懶，就作過10%,，12.5%的,，不過覺得都不適合。
