IEF（not IPG）/SDS-PAGE
最簡單的裝備推薦如下,，適合于沒多少money做IPG又想做“熱”的所謂蛋白質(zhì)組的，嘻嘻！
IEF用Biorad的圓盤電泳槽（不行用國產(chǎn)的吧,，不推薦）,，SDS-PAGE用六一廠的就可以了（ft，六一廠應(yīng)該給我money吧,，給你做廣告了)(money不是很多的強(qiáng)烈推薦六一的,，買進(jìn)口電泳槽的錢留出來測搞出的差異蛋白質(zhì)的序列吧，呵呵）
BIO－RAD的圓盤電泳槽,，國產(chǎn)的不推薦,，因為 上槽 Biorad的鉑金絲凹進(jìn)去了一點，不是很進(jìn)去,，而國產(chǎn)的凹得太進(jìn)去了以至于電聚焦時產(chǎn)生的氣泡繞在鉑金絲一圈,，影響電聚焦。
雙向電泳
蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等（1986）的方法進(jìn)行,。100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制,，含10mM即0.07%β-巰基乙醇）,，混勻，-20℃沉淀1小時,，4℃,，15000 r/min離心15 min，棄上清,，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),，再于-20℃沉淀1小時，同上離心棄上清,，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干,。
按每mg干粉加入20μl（可調(diào)） UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸鉀,，1.25%SDS,，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,，pH3.5-10),，6% Triton X-100]，37℃育30min,，期間攪動幾次,，28度 （溫度低，高濃度的尿素會讓溶液結(jié)冰）16000 r/min離心15 min,，離心力越大時間長一點越好,！上清即可上樣電泳,?；蛘?70度保存
2 蛋白質(zhì)濃度測定
按Garrels（1983）的程序,，稍加改動。10μl上述用UKS液制得的蛋白質(zhì)樣品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,，冰浴30min后,，4℃，4000 r/min離心15min,，棄上清,，再加入100μl冷丙酮，同上離心5min,，棄上清,，凍干沉淀，用100μl PBS溶液復(fù)溶,，并按Bradford（1976）的程序測定蛋白質(zhì)濃度,。
說實話，好象Bradford法不太好做
2.3.1 電聚焦（IEF）
2.3.1.1 玻管準(zhǔn)備
干凈玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,，在16cm處作好標(biāo)記,垂直放在泡沫板上,。
電聚焦的管子，買原裝的也可以,，實在不行自己也可以做的,，1ml的移液管，內(nèi)徑1.5mm左右的,，長度取18cm,，用玻璃刀做，呵呵,，很容易的,；玻璃管的處理，先用2M的NaOH泡 至少 1hr,，用自來水沖后;用雙蒸水沖,，用雙蒸水泡至少1hr，中間至少換2,，3次水;后用2M的HCL泡至少1個小時,，用雙蒸水沖，（不能用自來水沖）,，然后雙蒸水泡至少1個小時,，中間換3，4次水,，可多泡一會,。最后泡在無水乙醇里面1hr,，轟干就可以用了.
2.3.1.2 凝膠制備與電聚焦
灌IEF的配方
為3.09克尿素
1.125 ml 10%NP-40
1.125ml 水
0.735ml 30%屏息現(xiàn)案 (ACR 28.38 BIS 1.62)
0.15 ml Am 3.5-10
0.375ml Am 5-7
8衛(wèi)生 10%AP
1.8衛(wèi)生 TEMED
用注射器吸好膠液，裝上7號針頭,，將7號針頭插入玻管底部,，邊推注射器邊提針頭，直到標(biāo)記處,，用微量進(jìn)樣器小心加入少量水,，可見明顯的界面出現(xiàn)，讓其聚合1小時以上,，適當(dāng)長一點的時間好一些,，我一般是頭天下午灌膠，第2天下午才開始跑電泳,。待膠聚合好后,，除去Parafilm并吸去頂部的覆蓋液，加樣80μg,，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破壞樣品與NaOH的界面,。即可進(jìn)行電泳。電極液為：上槽（負(fù)極）為50m mol/L NaOH液,，下槽（正極）為25m mol/L H3PO4,。按200V×15min，300V×30min,，400V×18h,，1000V×1h的程序進(jìn)行電聚焦?；蛘咧苯?00V 17hr 1000V 2hr very important thing is 跑第一向一定要在保持在37度左右,特別是冬天,我的方法是 溫控儀控制 暖風(fēng)機(jī) 在37度 暖風(fēng)機(jī)和電泳槽在一個大的紙箱(密封)里.呵呵,應(yīng)該可以想象得到吧,第一向溫度特別重要,不然,電聚焦肯定做不好.
2.3.1.3 電泳后的凝條處理
電聚焦完畢后,，用注射器吸滿水，套上一個200μl的槍頭,，當(dāng)然槍頭與注射器間用parafilm封住防漏氣,。從頂部向下注水使膠條向下滑出。當(dāng)然,，剛開始做的時候肯定不熟,，很不爽，有時候你會唱 想哭卻又哭不出來,，呵呵,，熟悉了就快了，注射器 槍頭 玻璃管必須為一直線,，消息不要把注射器的頭搞斷了,。
取一膠條，用雙蒸水洗凈兩端,，按酸端到堿端的順序切成0.5cm的小段,，各自浸入含1.3ml抽氣后雙蒸水的Eppendorf管中過夜,，次日用酸度計分別測定各段的pH值，以凝膠長度為橫坐標(biāo),，pH值為縱坐標(biāo)作圖,，即為等電點標(biāo)準(zhǔn)曲線。
漫漫擠,管子,200衛(wèi)生槍頭,注射器,要成一直線,,要用一手扶著管子,一手拿住200衛(wèi)生槍頭,保證水不從槍頭和管子處流出來, 注射器頂在胸前
把膠條擠出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,，想什么時候跑SDS-PAGE就什么時候跑,。絕招哦,不要隨便亂傳,嘿嘿,！還可以馬上看一下,膠條上有蛋白質(zhì)沒有,有的話一下就可以看見了,。那些說什么放在平衡液里,-20度的,肯定不行,呵呵！就跟你用考染IEF膠條一樣的,帶,可能先在12%的TCA里面看不見,不過你再把它放在水里面,泡一會帶就出來了,。不過在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要換至少5次水,每次用不同的小平皿,。
注意到下級液 磷酸 部分的膠條沒，是不是有一節(jié)約2cm左右,，比較突出,，沒有膨大的部分呀！只是在tca泡的時候磷酸段有一小截變白的速度比較慢,，大約3cm左右,，呵呵!
對要進(jìn)行第二向SDS-PAGE的膠條則必須用平衡液[2.3%SDS，62.5m mol/L Tris-HCL（pH6.8）,，10%甘油,，5%β－巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)]進(jìn)行二次平衡,，第一次20min,，第二次25min。第2次的溶液為新的,。一般我是把第2次用過的當(dāng)成第一次的用 ,。平衡過程中每隔幾min輕輕的晃一下小平皿。
2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
選用DYY-Ⅲ型（北京六一儀器廠生產(chǎn)）電泳槽（規(guī)格為200×200×1mm）,，分離膠濃度為12%,，無濃縮膠。待膠聚合后,，將電聚焦后已經(jīng)平衡的膠條平放于濃縮膠頂端（避免膠條拉直）,，并用1%瓊脂糖（電極緩沖液配制）封膠，特別應(yīng)注意避免膠條與分離膠上沿產(chǎn)生氣炮,。61廠板子之灌膠：堅決不用凡士林,，用透明膠將兩端（板子的2邊）封住，再用2%瓊脂之SDS-PAGE電極液封底,，待瓊脂凝固后再灌膠,，最后用水封膠,。over！
做之前,，一定要保證,，1，灌膠不會有任何問題,，不能漏,，2，不用濃縮膠,，只用分離膠,。3，分離膠用水封,，要保證凝聚好的PAGE膠,，為一平的線，凹來凸去的就不要用了,。玻璃版能用硅化劑最好不過了,。防止從邊上漏，我用透明膠（約4cm寬）,，封住兩邊,，下面還是用2％的瓊脂封。灌好電極緩沖液[25m mol/L Tris,，192m mol/L甘氨酸及0.1%SDS],，按25mA/板膠恒流進(jìn)行電泳，待溴酚蘭離底部1cm時即可停止電泳,，一般電泳耗時約4-5h,。
銀染：凝膠于40%甲醇，10%醋酸中固定1h以上或者過夜,；用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min,；水洗6×5min； 0.02%硫代硫酸鈉1min,；水洗3×20s,；0.2%硝酸銀，0.02%甲醛快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;0.2%硝酸銀,，0.02%甲醛20min,；水洗3×20s；顯色液(3%碳酸鈉,，0.05%甲醛,，0.0005%硫代硫酸鈉)快速的潤洗一次,就是過一下的意思,到這個溶液進(jìn)去,馬上又倒掉;顯色液(3%碳酸鈉，0.05%甲醛,，0.0005%硫代硫酸鈉)顯色到你所希望的程度,自己看,背景好,點又多的話就可以了,；水洗20秒,；0.05%甘氨酸停顯。
染色理想溫度：我去年4,5月時,通常染色都定在中午,12點多;溫度最好是20度左右,(這個溫度我也沒控制的)
100%TCA
領(lǐng)一瓶TCA 500g的那種 按分子克隆上的好象是直接加200多ml水就成100%TCA了
10%TCA, 0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
100%TCA 10ml
2-ME 0.07ml
丙酮 90ml
0.07%2-ME 丙酮 （100ml）:
2-ME 0.07ml
丙酮 100ml
0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)
50ml
Urea 28.5g
NP-40 1ml
Ampholine 5~7 2.0ml
3.5~10 0.5ml
2-ME 2.5ml
注意定容,！配好后用1.5ml管分裝,！-70度保存
注意 這兩個溶液 配的時候 比如配 50ml 用100ml的燒杯 用量筒量50ml水 倒如燒杯里面，用記號筆標(biāo)上刻度,，然后把水倒掉,，再稱 尿素 小量加水，因為尿素加水后體積會變大,，再37度水域鍋里溶,，然后加其它成分，最后再定到50ml
(2002-10-30 18:39:37)
UKS液 (含9.5M Urea, 5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)
25ml 50ml
Urea 14.25g 28.5g
K2CO3 17.25mg 34.5mg
SDS 0.3125g 0.625g
DTT 0.125g 0.25g
2-ME
Ampholine(3.5~10) 1.25ml 2.5ml
Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2槍,，4槍)
2-ME可適當(dāng)加一些,！注意定容！配好后用1.5ml管分裝,！-70度保存！
