結(jié)合到DNA(橙色)上的鋅指核酸酶(藍(lán)色)，圖片來自維基共享資源,，Thomas Splettstoesser
【towersimper注：本文為譯文,，僅用作研究之用，不得用作商業(yè)開發(fā),，轉(zhuǎn)載請標(biāo)明翻譯者towersimper,，原文來自Tia Ghose, The Scientist, "When ZincFingers Miss the Mark", August 7, 2011】
鋅指核酸酶(zincfinger nucleases, ZFNs)被設(shè)計(jì)為類似于熱跟蹤導(dǎo)彈，精確地導(dǎo)向以便找到并切割特異性DNA序列,。然而,，它們偶爾可能會剪錯位點(diǎn)，導(dǎo)致未曾預(yù)料到的裂口,。2011年8月7日發(fā)表在Nature雜志子刊上的兩篇論文描述了兩種系統(tǒng)性地找到這種脫靶作用(off-target action)的方法,，從而能夠有朝一日有助于設(shè)計(jì)出避免間接傷害的基因治療。
美國斯克利普斯研究所拉由拉市分所(The ScrippsResearch Institute in La Jolla)化學(xué)生物學(xué)者Carlos Barbas(未參與該項(xiàng)研究)說,，“直到現(xiàn)在還沒有一種真正綜合性的方法來定義ZFN的特異性”,，“當(dāng)我們開始利用ZFNs治療病人和修飾基因組時，我們需要知道這些修飾是在哪些序列位點(diǎn)進(jìn)行的”,。
鋅指(zinc fingers, ZFs),，是因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)像只一個指頭伸出的手而得名，結(jié)合到不同的三字母核苷酸序列,。通過將幾個鋅指出串聯(lián)在一起,，再加入一個切割DNA的核酸酶，研究人員們能夠精確地導(dǎo)向?qū)⒈磺懈畹奶禺愋曰?。這種特異性就為開發(fā)ZFN基因治療提供可能,。確實(shí)，一家制藥公司Sangamo Biosciences正在人類安全性試驗(yàn)中測試一種治療HIV的候選藥物,，其中該試驗(yàn)利用一種ZFN修飾HIV用來侵入細(xì)胞的T細(xì)胞受體CCR-5,。
但是它不是一個完美的系統(tǒng)：有時這種分子可能結(jié)合并剪斷一種不同但又幾乎相同的DNA序列，從而潛在性地殺死細(xì)胞,。
為了系統(tǒng)性地描述這些脫靶切割位點(diǎn),，哈佛大學(xué)化學(xué)生物學(xué)者David Liu和他的同事們利用1000億個DNA片段組成的文庫---一些片段在人類基因組中出現(xiàn)---對兩種ZFN進(jìn)行測試。大多數(shù)情況下,，這些核酸酶切割靶位點(diǎn),，但是它們偶爾也切割其他類似序列---包括一種與癌癥信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)聯(lián)的基因。
Liu說,，“對我們論文的膚淺理解可能導(dǎo)致一個人對ZFNs持悲觀態(tài)度,，但是實(shí)際上我是樂觀的”。他說,，除了證實(shí)脫靶裂口所占份額會隨著較低濃度的ZFNs下降外,，研究人員們還發(fā)現(xiàn)使用與靶序列結(jié)合較差的ZFNs似乎產(chǎn)生更少的意料之外的裂口,。這就表明有可能設(shè)計(jì)出使得這些脫靶效應(yīng)最小化的ZFN治療。研究人員們將他們的研究成果發(fā)表在Nature Methods雜志上,。
在第二篇發(fā)表在 Nature Biotechnology雜志上的研究論文中,，研究人員們給人白血病細(xì)胞施加一種切割CCR-5受體的ZFN。他們首先構(gòu)建結(jié)合到DNA裂口末端的帶有標(biāo)記的病毒顆粒,，然后利用這些病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，來鑒定ZFN切割位點(diǎn),，結(jié)果他們發(fā)現(xiàn)ZFN總體上結(jié)合到靶CCR-5 DNA序列,。但是，它大約2萬分之一的概率切割序列幾乎相同的另一個受體基因,，以及甚至更低概率地切割少數(shù)幾個其他的類似序列,。但是Sangamo BioSciences公司科技總監(jiān)Phillip Gregory以及這篇研究論文的共同作者Phillip Gregory說，這些結(jié)果都是在研究人員們采用一種極度高濃度的ZFN和極易允許ZFN作用的細(xì)胞系的條件下進(jìn)行的,，目的是觀察最糟糕的情形會是什么樣子,。他說，即便是在這些條件下,，低概率的脫靶切割事件“證明我們的期望：ZFNs蛋白定會是高度特異性的”,，而且暗示在臨床中采用更低藥用劑量將幾乎不可能發(fā)生脫靶切割。
Barbas說,，這些方法可能有朝一日用于早期藥物開發(fā)以便篩選特異性最好的候選藥物,。他說，人們不清楚這些新ZFN測試的覆蓋面是否剛剛好,。比如,，采用帶有標(biāo)記的病毒顆粒的方法可能會遺失一些脫靶切割，因?yàn)椴《緲?biāo)記可能并不結(jié)合到每個單裂口,。再者,，Barbas補(bǔ)充道，不同于試管中的DNA,，細(xì)胞DNA緊密纏繞成染色質(zhì),，因而在試管方法中發(fā)現(xiàn)的很多結(jié)合位點(diǎn)可能在活細(xì)胞得到保護(hù)并且從不會被ZFNs切割。
他說,，盡管這些新的測試方法可能成為早期藥物開發(fā)的關(guān)鍵性工具,，但是一幅完整的ZFN脫靶位點(diǎn)圖僅當(dāng)花費(fèi)1000美元獲得一個人的全部基因組序列的情況下才會出現(xiàn)，屆時研究人員們能夠?qū)邮躗FN治療的人們進(jìn)行測試以便找到每個脫靶裂口,。
R. Gabriel, et. al, “An unbiased genome-wideanalysis of zinc-finger nuclease specificity,” Nature Biotechnology,doi:10.1038/nbt.1948, 2011.
V. Pattanayak, et. al, “Revealing off-targetcleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection,” NatureMethods, doi:10.1038/nmeth.1670, 2011.
