來自中科院上海生化與細(xì)胞所的研究人員利用一種新研究體系：結(jié)核分支桿菌亮氨酰-tRNA合成酶(MtbLeuRS) ,，發(fā)現(xiàn)了原核病原菌亮氨酰-tRNA合成酶的C-端延伸結(jié)構(gòu)域在維持酶與核酸相互作用方面的重要機(jī)制，相關(guān)成果公布在Nucleic Acids Research雜志上,。
這項(xiàng)研究由王恩多研究組完成,，第一作者為胡慶華博士,。王恩多院士長期從事酶學(xué)和酶與核酸的相互作用的研究,，在蛋白質(zhì)生物合成中關(guān)鍵的氨基酰-tRNA合成酶與tRNA相互作用的研究中做出了重要貢獻(xiàn),，于2005年當(dāng)選為中國科學(xué)院院士。2006年當(dāng)選為第三世界科學(xué)院院士,。
肺結(jié)核(tuberculosis, TB)是威脅全世界人類健康的重大傳染性疾病,。截至2009年底WHO的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，全球約有1/3的人口感染結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis）——肺結(jié)核的主要致病菌,。當(dāng)前，耐多藥結(jié)核桿菌的蔓延（multi-drug resistant TB, MDR-TB）對臨床抗生素療法提出了挑戰(zhàn),，迫切需要開發(fā)新型抗生素,。
細(xì)菌中基因的表達(dá)調(diào)控過程一直是藥物研發(fā)人員尋找靶點(diǎn)的途徑。近年來,，在蛋白質(zhì)合成起始發(fā)揮作用的氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)以其獨(dú)特的優(yōu)勢成為抗生素新藥開發(fā)的一個(gè)理想靶點(diǎn),。
首先，aaRS普遍存在于自然界有細(xì)胞的生命體內(nèi),，維持了細(xì)胞的基本生命活動(dòng),，其功能的缺失將影響細(xì)胞的生長。其次,，不同物種來源的aaRS在結(jié)構(gòu)和分子催化機(jī)制上的差異,，為開發(fā)具有選擇性的藥物提供了可能。再次,，多達(dá)20種的aaRS增加了藥物靶點(diǎn)的選擇性,。此外，在臨床外傷感染有近30年應(yīng)用史的細(xì)菌異亮氨酰-tRNA合成酶抑制劑——莫匹羅星（商品名百多邦）,，以及進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)將用于灰指甲治療的亮氨酰-tRNA合成酶抑制劑——5-氟-1,3-二氫-1-羥基-2,1-苯并硼烷（AN2690）, 更為以aaRS為靶點(diǎn)的抗生素研發(fā)增添了信心,。
在這篇文章中，研究人員用建立的結(jié)核分支桿菌亮氨酰-tRNA合成酶(MtbLeuRS) 的研究體系圍繞C-端延伸結(jié)構(gòu)域(CTD)開展了一系列的工作,，他們利用大腸桿菌基因表達(dá)體系獲得了高活力的MtbLeuRS和結(jié)核桿菌亮氨酸t(yī)RNA(Mtb-tRNALeu),，建立了一個(gè)高效的MtbLeuRS/Mtb-tRNALeu研究體系,，并通過定量分析MtbLeuRS的編校反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它編校正纈氨酸(Nva)偏好依賴tRNA的轉(zhuǎn)移前編校途徑,，占總編校反應(yīng)的70%, 是已報(bào)道的LeuRS中最高的,。
并且研究人員鑒定出對維持酶構(gòu)象及酶與核酸相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，借助熒光滴定和酵母三雜交手段發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的突變都會(huì)影響酶與tRNA的結(jié)合,。研究人員還從立體結(jié)構(gòu)分析了CTD與酶的主體部分的連接肽段的柔性與酶活力的關(guān)系,，揭示了CTD的靈活性在調(diào)節(jié)底物結(jié)合、氨基?；熬幮７磻?yīng)中酶與tRNA的相互作用的重要性,，鑒定出調(diào)節(jié)構(gòu)象的至關(guān)重要的一個(gè)位點(diǎn)。
這項(xiàng)研究豐富了人們對酶與tRNA的精確識(shí)別質(zhì)量控制蛋白質(zhì)合成第一步反應(yīng)的認(rèn)識(shí),，同時(shí)建立的MtbLeuRS/Mtb-tRNALeu研究系統(tǒng)也為篩選抗結(jié)核病新藥提供了研究平臺(tái),。(生物谷Bioon.com)
doi: 10.1093/nar/gks1307
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Crucial role of the C-terminal domain ofMycobacterium tuberculosis leucyl-tRNA synthetase in aminoacylation and editing
Qing-Hua Hu, Qian Huang and En-Duo Wang*
The C-terminal extension of prokaryotic leucyl-tRNA synthetase (LeuRS) has been shown to make contacts with the tertiary structure base pairs of tRNALeu as well as its long variable arm. However, the precise role of the flexibly linked LeuRS C-terminal domain (CTD) in aminoacylation and editing processes has not been clarified. In this study, we carried out aspartic acid scanning within the CTD of Mycobacterium tuberculosisLeuRS (MtbLeuRS) and studied the effects on tRNALeu-binding capacity and enzymatic activity. Several critical residues were identified to impact upon the interactions between LeuRS and tRNALeu due to their contributions in the maintenance of structural stability or a neutral interaction interface between the CTD platform and tRNALeu elbow region. Moreover, we propose Arg921 as a crucial recognition site for the tRNALeulong variable arm in aminoacylation and tRNA-dependent pre-transfer editing. We also show here the CTD flexibility conferred by Val910 in regulation of LeuRS–tRNALeu interaction. Taken together, our results suggest the structural importance of the CTD in modulating precise interactions between LeuRS and tRNALeu during the quality control of leucyl-tRNALeu synthesis. This system for the investigation of the interactions between MtbLeuRS and tRNALeu provides a platform for the development of novel antitubercular drugs.
