關(guān)鍵詞： RNAi
長期基因抑制
有效的基因抑制
瞬時和長期的基因沉默研究
轉(zhuǎn)染細胞的富集
近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一些小的雙鏈RNA可以通過促使mRNA降解,，高效,、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達。稱為RNA干擾（RNA interference,，RNAi）,。由于RNAi可以作為一種簡單有效的代替基因敲除的工具，在功能基因組學(xué)研究,、基因治療等領(lǐng)域得到了越來越多的重視,。為此被Science評為2001年最重要成果之一。RNAi,，即引入雙鏈RNA,，通過特異性結(jié)合互補鏈從而抑制基因表達/引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默。許多的研究人員開始用RNAi作為一種工具研究基因功能,。較早的哺乳動物RNAi實驗中,，siRNAs通過化學(xué)方法合成。進一步的,，開始有了商業(yè)化的體外轉(zhuǎn)錄方法合成siRNA的試劑盒提供,，比化學(xué)合成方法經(jīng)濟。現(xiàn)在已有研究小組開發(fā)表達載體,，能夠在哺乳動物細胞中持續(xù)表達siRNAs,。Stratagene的新產(chǎn)品GeneEraser™ shRNA expression vector，可以表達shRNA,，在體內(nèi)加工后形成類似siRNAs的分子,，能夠引發(fā)RNAi過程。
小干擾RNA分子(siRNA)已迅速成為一個通過抑制目的基因的表達來研究哺乳動物基因產(chǎn)物功能的強大的工具,。通常這些短的，雙鏈RNA分子(shRNA)是由體外產(chǎn)生且價格昂貴。采用Pol III啟動子在體內(nèi)表達短發(fā)夾RNA(shRNA)是有效的降低基因表達一個更為經(jīng)濟的方法,。Strtagene開發(fā)了GeneEraser shRNA表達系統(tǒng)優(yōu)化了shRNA的表達及基因的抑制,。體外合成siRNA的方法盡管非常有效，但其抑制的持久性通常僅有5-7天,，使之不能用來進行長期的基因抑制,。而用體內(nèi)表達短發(fā)夾RNA的方法，使不能持久抑制基因表達的問題迎刃而解,。
shRNA 是怎樣工作的,？
產(chǎn)生dsRNA分子的另一個有效的方法是在體內(nèi)表達一個短發(fā)夾RNA分子(shRNA)。這種shRNA包含兩個由一個小環(huán)序列所分離的短反向重復(fù)序列,，是由Pol III啟動子控制的,。其中一個反向重復(fù)序列與目的基因互補。ShRNA隨后被加工成siRNA,降解目的基因mRNA,、抑制表達,。
有效抑制
GeneEraser shRNA 表達系統(tǒng)包括pGE-1載體及合適的對照用來在實驗室中建立起系統(tǒng)。我們選擇人類的U6啟動子以有效的表達 shRNA,。該啟動子控制下,，該系統(tǒng)在多種細胞系中都顯示出對熒光素酶(對照)的持久的抑制，其持久的表達水平降低達到80-95%,。
哺乳動物的選擇標(biāo)記
PGE-1載體采用常見的pCMV-Script 作為骨架,，在E.coli中提供了卡那選擇標(biāo)記，在哺乳動物中為新霉素,。哺乳動物的選擇標(biāo)記給你的實驗帶來很多便利,，特別當(dāng)轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)?shù)蜁r。通過挑選包含pGE-1載體的細胞,，包含和表達shRNA的細胞數(shù)量被富集,，可以用來作長期抑制的分析。
提供對照
實驗室里新建一個系統(tǒng)常常很困難,，所以我們提供GeneEraser shRNA expression controls,，幫助剛剛投身于siRNA領(lǐng)域的研究者。此試劑盒包括熒光素酶表達質(zhì)粒(pCMV-luc),，這是一個shRNA載體,，表達抑制熒光素酶基因的shRNA(pGE-1-shluc)。另外提供陰性對照,，其表達的shRNA與人,、小鼠和大鼠的基因組沒有任何同源性。
目的序列的選擇
基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇,。目的序列可以隨機選擇也可以通過在目的基因的不同區(qū)域上測試不同的序列以決定何種序列是最有效的,。以下所述幾條對于shRNA設(shè)計的成功極為重要。
選擇跟有AA序列的29個堿基，正義鏈和反義鏈都采用這29個堿基(不包括AA重復(fù))來設(shè)計寡核苷酸,。
避免在起始密碼子或無義區(qū)域附近選擇目的序列,。
ShRNA序列的GC含量應(yīng)為40%-50%左右。
將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性,。
寡核苷酸的設(shè)計
通?？寺≡趕hRNA表達載體中的shRNA包括兩個由一莖環(huán)序列分隔的反向重復(fù)序列，隨后在連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子,。
兩個互補的寡核苷酸需帶有5'BamHI和3'XbaI接頭,。
Stratagene發(fā)現(xiàn)29個寡核苷酸較之原先推薦的23個寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
在BamHI位點下游緊連一個C使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生,。
ShRNA目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄,。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個G,。
ShRNA插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央,。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運用過。其中包含一個獨特的限制性酶切位點的莖環(huán)利于檢測帶有shRNA插入片段的克隆,。如上圖所示的莖環(huán)序列就包含一個HindIII酶切位點,。5'TTCG3'通常作為莖環(huán)序列。而在比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán),，5'TCAAGAG3'序列最為有效,。
5-6個T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄。
在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個或以上的T,。這可能導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止,。
If the upper strand of the target sequence does not begin with a G nucleotide, a G must be included immediately upstream of the target sequence.
Figure 3 shRNA insert design.
