關鍵詞： RNAi
長期基因抑制
有效的基因抑制
瞬時和長期的基因沉默研究
轉染細胞的富集
近年來的研究發(fā)現,，一些小的雙鏈RNA可以通過促使mRNA降解，高效,、特異的阻斷體內特定基因表達,。稱為RNA干擾（RNA interference,，RNAi）。由于RNAi可以作為一種簡單有效的代替基因敲除的工具,，在功能基因組學研究,、基因治療等領域得到了越來越多的重視。為此被Science評為2001年最重要成果之一,。RNAi,，即引入雙鏈RNA，通過特異性結合互補鏈從而抑制基因表達/引發(fā)轉錄后沉默,。許多的研究人員開始用RNAi作為一種工具研究基因功能,。較早的哺乳動物RNAi實驗中，siRNAs通過化學方法合成,。進一步的,，開始有了商業(yè)化的體外轉錄方法合成siRNA的試劑盒提供，比化學合成方法經濟?，F在已有研究小組開發(fā)表達載體,，能夠在哺乳動物細胞中持續(xù)表達siRNAs。Stratagene的新產品GeneEraser™ shRNA expression vector,，可以表達shRNA,，在體內加工后形成類似siRNAs的分子，能夠引發(fā)RNAi過程,。
小干擾RNA分子(siRNA)已迅速成為一個通過抑制目的基因的表達來研究哺乳動物基因產物功能的強大的工具,。通常這些短的，雙鏈RNA分子(shRNA)是由體外產生且價格昂貴,。采用Pol III啟動子在體內表達短發(fā)夾RNA(shRNA)是有效的降低基因表達一個更為經濟的方法,。Strtagene開發(fā)了GeneEraser shRNA表達系統(tǒng)優(yōu)化了shRNA的表達及基因的抑制。體外合成siRNA的方法盡管非常有效,，但其抑制的持久性通常僅有5-7天,，使之不能用來進行長期的基因抑制。而用體內表達短發(fā)夾RNA的方法,，使不能持久抑制基因表達的問題迎刃而解,。
shRNA 是怎樣工作的？
產生dsRNA分子的另一個有效的方法是在體內表達一個短發(fā)夾RNA分子(shRNA),。這種shRNA包含兩個由一個小環(huán)序列所分離的短反向重復序列,，是由Pol III啟動子控制的。其中一個反向重復序列與目的基因互補,。ShRNA隨后被加工成siRNA,降解目的基因mRNA,、抑制表達,。
有效抑制
GeneEraser shRNA 表達系統(tǒng)包括pGE-1載體及合適的對照用來在實驗室中建立起系統(tǒng)。我們選擇人類的U6啟動子以有效的表達 shRNA,。該啟動子控制下,，該系統(tǒng)在多種細胞系中都顯示出對熒光素酶(對照)的持久的抑制，其持久的表達水平降低達到80-95%,。
哺乳動物的選擇標記
PGE-1載體采用常見的pCMV-Script 作為骨架,，在E.coli中提供了卡那選擇標記，在哺乳動物中為新霉素,。哺乳動物的選擇標記給你的實驗帶來很多便利,，特別當轉染效率相當低時,。通過挑選包含pGE-1載體的細胞，包含和表達shRNA的細胞數量被富集，可以用來作長期抑制的分析,。
提供對照
實驗室里新建一個系統(tǒng)常常很困難,，所以我們提供GeneEraser shRNA expression controls,，幫助剛剛投身于siRNA領域的研究者,。此試劑盒包括熒光素酶表達質粒(pCMV-luc)，這是一個shRNA載體,，表達抑制熒光素酶基因的shRNA(pGE-1-shluc),。另外提供陰性對照，其表達的shRNA與人,、小鼠和大鼠的基因組沒有任何同源性,。
目的序列的選擇
基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇。目的序列可以隨機選擇也可以通過在目的基因的不同區(qū)域上測試不同的序列以決定何種序列是最有效的,。以下所述幾條對于shRNA設計的成功極為重要,。
選擇跟有AA序列的29個堿基，正義鏈和反義鏈都采用這29個堿基(不包括AA重復)來設計寡核苷酸,。
避免在起始密碼子或無義區(qū)域附近選擇目的序列,。
ShRNA序列的GC含量應為40%-50%左右。
將挑選的序列在公共數據庫中進行比較以確保目的序列與其它基因沒有同源性,。
寡核苷酸的設計
通?？寺≡趕hRNA表達載體中的shRNA包括兩個由一莖環(huán)序列分隔的反向重復序列，隨后在連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子,。
兩個互補的寡核苷酸需帶有5'BamHI和3'XbaI接頭,。
Stratagene發(fā)現29個寡核苷酸較之原先推薦的23個寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。
在BamHI位點下游緊連一個C使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發(fā)生,。
ShRNA目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉錄,。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個G,。
ShRNA插入片段中的莖環(huán)應當靠近寡核苷酸的中央,。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運用過。其中包含一個獨特的限制性酶切位點的莖環(huán)利于檢測帶有shRNA插入片段的克隆,。如上圖所示的莖環(huán)序列就包含一個HindIII酶切位點,。5'TTCG3'通常作為莖環(huán)序列。而在比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán),，5'TCAAGAG3'序列最為有效,。
5-6個T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉錄。
在正義鏈和反義鏈序列上不能出現連續(xù)3個或以上的T,。這可能導致shRNA轉錄的提前終止,。
If the upper strand of the target sequence does not begin with a G nucleotide, a G must be included immediately upstream of the target sequence.
Figure 3 shRNA insert design.
