關(guān)鍵詞： RNAi
長(zhǎng)期基因抑制
有效的基因抑制
瞬時(shí)和長(zhǎng)期的基因沉默研究
轉(zhuǎn)染細(xì)胞的富集
近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),，一些小的雙鏈RNA可以通過(guò)促使mRNA降解，高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)。稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。由于RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單有效的代替基因敲除的工具，在功能基因組學(xué)研究,、基因治療等領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的重視。為此被Science評(píng)為2001年最重要成果之一,。RNAi,，即引入雙鏈RNA，通過(guò)特異性結(jié)合互補(bǔ)鏈從而抑制基因表達(dá)/引發(fā)轉(zhuǎn)錄后沉默,。許多的研究人員開(kāi)始用RNAi作為一種工具研究基因功能,。較早的哺乳動(dòng)物RNAi實(shí)驗(yàn)中，siRNAs通過(guò)化學(xué)方法合成,。進(jìn)一步的,，開(kāi)始有了商業(yè)化的體外轉(zhuǎn)錄方法合成siRNA的試劑盒提供，比化學(xué)合成方法經(jīng)濟(jì)?，F(xiàn)在已有研究小組開(kāi)發(fā)表達(dá)載體,，能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)siRNAs。Stratagene的新產(chǎn)品GeneEraser™ shRNA expression vector,，可以表達(dá)shRNA,，在體內(nèi)加工后形成類似siRNAs的分子，能夠引發(fā)RNAi過(guò)程,。
小干擾RNA分子(siRNA)已迅速成為一個(gè)通過(guò)抑制目的基因的表達(dá)來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物功能的強(qiáng)大的工具,。通常這些短的，雙鏈RNA分子(shRNA)是由體外產(chǎn)生且價(jià)格昂貴,。采用Pol III啟動(dòng)子在體內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾RNA(shRNA)是有效的降低基因表達(dá)一個(gè)更為經(jīng)濟(jì)的方法,。Strtagene開(kāi)發(fā)了GeneEraser shRNA表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化了shRNA的表達(dá)及基因的抑制,。體外合成siRNA的方法盡管非常有效,，但其抑制的持久性通常僅有5-7天，使之不能用來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)期的基因抑制,。而用體內(nèi)表達(dá)短發(fā)夾RNA的方法,，使不能持久抑制基因表達(dá)的問(wèn)題迎刃而解。
shRNA 是怎樣工作的？
產(chǎn)生dsRNA分子的另一個(gè)有效的方法是在體內(nèi)表達(dá)一個(gè)短發(fā)夾RNA分子(shRNA),。這種shRNA包含兩個(gè)由一個(gè)小環(huán)序列所分離的短反向重復(fù)序列,，是由Pol III啟動(dòng)子控制的。其中一個(gè)反向重復(fù)序列與目的基因互補(bǔ),。ShRNA隨后被加工成siRNA,降解目的基因mRNA,、抑制表達(dá)。
有效抑制
GeneEraser shRNA 表達(dá)系統(tǒng)包括pGE-1載體及合適的對(duì)照用來(lái)在實(shí)驗(yàn)室中建立起系統(tǒng),。我們選擇人類的U6啟動(dòng)子以有效的表達(dá) shRNA,。該啟動(dòng)子控制下，該系統(tǒng)在多種細(xì)胞系中都顯示出對(duì)熒光素酶(對(duì)照)的持久的抑制,，其持久的表達(dá)水平降低達(dá)到80-95%,。
哺乳動(dòng)物的選擇標(biāo)記
PGE-1載體采用常見(jiàn)的pCMV-Script 作為骨架，在E.coli中提供了卡那選擇標(biāo)記,，在哺乳動(dòng)物中為新霉素,。哺乳動(dòng)物的選擇標(biāo)記給你的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)很多便利，特別當(dāng)轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)?shù)蜁r(shí),。通過(guò)挑選包含pGE-1載體的細(xì)胞,，包含和表達(dá)shRNA的細(xì)胞數(shù)量被富集，可以用來(lái)作長(zhǎng)期抑制的分析,。
提供對(duì)照
實(shí)驗(yàn)室里新建一個(gè)系統(tǒng)常常很困難,，所以我們提供GeneEraser shRNA expression controls，幫助剛剛投身于siRNA領(lǐng)域的研究者,。此試劑盒包括熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-luc),，這是一個(gè)shRNA載體，表達(dá)抑制熒光素酶基因的shRNA(pGE-1-shluc),。另外提供陰性對(duì)照,，其表達(dá)的shRNA與人、小鼠和大鼠的基因組沒(méi)有任何同源性,。
目的序列的選擇
基因抑制的有效性很大程度取決于目的基因序列的選擇,。目的序列可以隨機(jī)選擇也可以通過(guò)在目的基因的不同區(qū)域上測(cè)試不同的序列以決定何種序列是最有效的。以下所述幾條對(duì)于shRNA設(shè)計(jì)的成功極為重要,。
選擇跟有AA序列的29個(gè)堿基,，正義鏈和反義鏈都采用這29個(gè)堿基(不包括AA重復(fù))來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸。
避免在起始密碼子或無(wú)義區(qū)域附近選擇目的序列,。
ShRNA序列的GC含量應(yīng)為40%-50%左右,。
將挑選的序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比較以確保目的序列與其它基因沒(méi)有同源性。
寡核苷酸的設(shè)計(jì)
通?？寺≡趕hRNA表達(dá)載體中的shRNA包括兩個(gè)由一莖環(huán)序列分隔的反向重復(fù)序列,，隨后在連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶III的轉(zhuǎn)錄終止子,。
兩個(gè)互補(bǔ)的寡核苷酸需帶有5'BamHI和3'XbaI接頭。
Stratagene發(fā)現(xiàn)29個(gè)寡核苷酸較之原先推薦的23個(gè)寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因,。
在BamHI位點(diǎn)下游緊連一個(gè)C使插入片段和啟動(dòng)子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生,。
ShRNA目的序列的第一個(gè)堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以G開(kāi)頭,，必須在緊連正義鏈的上游加一個(gè)G,。
ShRNA插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的莖環(huán)都被成功的運(yùn)用過(guò),。其中包含一個(gè)獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)的莖環(huán)利于檢測(cè)帶有shRNA插入片段的克隆,。如上圖所示的莖環(huán)序列就包含一個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)。5'TTCG3'通常作為莖環(huán)序列,。而在比較了眾多不同長(zhǎng)度和序列的莖環(huán),，5'TCAAGAG3'序列最為有效。
5-6個(gè)T必須放置在shRNA插入片段尾部以確保RNA聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄,。
在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù)3個(gè)或以上的T,。這可能導(dǎo)致shRNA轉(zhuǎn)錄的提前終止。
If the upper strand of the target sequence does not begin with a G nucleotide, a G must be included immediately upstream of the target sequence.
Figure 3 shRNA insert design.
