關(guān)鍵詞： RNAi
小分子干擾RNA(Small interfering RNA,，siRNA)是一種非常有效的工具,，能夠在包括哺乳動物細(xì)胞在內(nèi)的多個(gè)體系中抑制特定基因的表達(dá)，從而研究某個(gè)基因的功能或者是相關(guān)信息,。但是這種強(qiáng)有力的方法的難題之一是需要設(shè)計(jì)，合成siRNAs和驗(yàn)證其效果，從而找到最有效的siRNAs,。這個(gè)過程需要花費(fèi)相當(dāng)?shù)臅r(shí)間和經(jīng)費(fèi)。以化學(xué)法合成基因特異的siRNAs為例,，由于設(shè)計(jì)好的siRNAs中通常只有大約25%的siRNAs能高效抑制基因的表達(dá)（抑制效率>80%）,，這使得化學(xué)合成siRNA的成本升高。體外轉(zhuǎn)錄制備長片斷RNA并不難,，但是由于研究表明長片斷的雙鏈RNA（>29bps）在哺乳動物細(xì)胞中通常會引發(fā)抗病毒反應(yīng)—— 一種非特異基因表達(dá)抑制,，而目前體外轉(zhuǎn)錄往往無法制備小于29bp的小分子siRNAs。一個(gè)新的研究發(fā)現(xiàn),，用RNase III 降解長片斷雙鏈RNA成為siRNAs庫也能夠有效誘導(dǎo)特異的基因沉默,，這樣可以避免了篩選有效siRNAs的漫長過程,，從而快速，經(jīng)濟(jì)的實(shí)現(xiàn)特定基因表達(dá)的沉默,。
在線蟲,、果蠅和其他一些物種的RNA干擾(RNA interference，RNAi)通路中,，長片斷的雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后會被一個(gè)類似RNase III的內(nèi)切核糖核酸酶(Dicer)降解為一系列的21—23bp長度,，3'端有兩個(gè)堿基突出（帶羥基）5'磷酸化的siRNAs。這些siRNAs介導(dǎo)同源轉(zhuǎn)錄本的降解,，從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默,。(1-5)
大腸桿菌Escherichia coli RNase III參與多種細(xì)菌RNAs，噬菌體甚至是質(zhì)粒來源的RNAs降解(6-9,，能夠?qū)㈤L片斷的雙鏈RNAs降解為一系列12—15bp的短雙鏈RNAs,，產(chǎn)物末端結(jié)構(gòu)類似Dicer降解產(chǎn)物(9)，通過改變RNAseIII的酶切條件可以提高降解產(chǎn)物的平均長度,，達(dá)到目前的21bp,。這些21bp的降解產(chǎn)物能夠有效介導(dǎo)在哺乳動物細(xì)胞和小鼠胚胎中特定基因的RNAi(10,11)。另外,，實(shí)驗(yàn)表明,，RNase III的完全降解產(chǎn)物（12—15bp）同樣可以誘導(dǎo)專一的基因沉默，效果與化學(xué)合成或者是酶法得到的siRNAs相當(dāng),。
驗(yàn)證RNaseIII的消化能力
采用RNaseIII分別消化體外轉(zhuǎn)錄制備的人源GAPDH,，La和c-FOS(200 bp)雙鏈RNA，從而驗(yàn)證RNaseIII的消化能力,，結(jié)果表明,，1個(gè)單位的RnaseIII在37度1小時(shí)可以將1mg的雙鏈RNA降解為30bp以下，主要是12—15bp的siRNAs混合物,。用其他基因的雙鏈RNA,，同樣證實(shí)RNaseIII能夠消化各種雙鏈RNA序列。另外用Cyclophillin, c-myc, Map Kinase 9, PKC-alpha, Raf-1, Nautilus, 和 h-ras等基因的雙鏈RNA作為RNase III底物,，也可以得到同樣的結(jié)果,。這表明RNase III能夠消化各種來源的雙鏈RNA。
驗(yàn)證RNaseIII降解產(chǎn)物誘導(dǎo)基因沉默的能力
GAPDH和La在Hela細(xì)胞中的豐度高,，也比較容易檢測內(nèi)源基因的表達(dá)水平,。將RNaseIII降解GAPDH和La得到的siRNAs庫轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，用免疫熒光法檢測其誘導(dǎo)基因沉默的能力,。根據(jù)所檢測的細(xì)胞數(shù)量對熒光信號進(jìn)行平衡化和定量,。但是內(nèi)源的c-FOS在293細(xì)胞中的豐度較低，表達(dá)水平下調(diào)后就難以檢測,，為了做同樣的驗(yàn)證,，實(shí)驗(yàn)采用50nM佛波脂 phorbol ester (PMA)提前24小時(shí)誘導(dǎo)處理使c-FOS 表達(dá)水平升高,。用由RNase III 消化c-FOS雙鏈RNA得到的siRNAs混合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用同樣方法檢測對基因表達(dá)的抑制效果,。結(jié)果顯示用RNase III 消化各種雙鏈RNA得到的siRNA庫對相應(yīng)的基因表達(dá)抑制效果分別是：GAPDH表達(dá)水平下調(diào)78%,，La表達(dá)水平下調(diào)86%，而c-FOS表達(dá)水平則下調(diào)75%,。這個(gè)結(jié)果表明RNase III 得到的siRNAs庫能夠非常有效的抑制基因的表達(dá)。
Figure 1. Silencing Gene Targets by RNase III Derived siRNA Cocktails. A 200 bp dsRNA (15 µg) for each gene of interest was digested with 2.5 U RNase III for 1 hour at 37°C. 1A. RNase III efficiently digests dsRNA. One microgram of the dsRNA before and after RNase III digestion was run on a 15% non-denaturing acrylamide gel along with a 21 bp chemically synthesized siRNA to GAPDH, which served as a size marker. The gel was stained with ethidium bromide and photographed under UV light. 1B. RNase III derived siRNA cocktails silence GAPDH, La and c-FOS. GAPDH and La siRNA cocktails were transfected into HeLa cells. The c-fos siRNA mixture was transfected into 293 cells followed by 24 hours of stimulation with 50 nM PMA. All samples were harvested at 48 hours post transfection and immunofluorescence was performed with the appropriate antibodies. Fluorescence signal was quantitated, normalized for cell number and graphed.
12-15bp的RNase III降解產(chǎn)物誘導(dǎo)基因沉默的效果
最常用于介導(dǎo)RNAi的化學(xué)合成siRNA通常是21bp大小,。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：用RNase III在特定條件下降解得到的21bp大小產(chǎn)物是非常有效的基因表達(dá)抑制劑,。然而RNase III 完全消化產(chǎn)物是12—15bp大小的片斷，為了要研究這些12-15bp大小的片斷抑制基因表達(dá)的效果,，一個(gè)200bp的GAPDH雙鏈RNA用RNase III完全消化得到12-15bp的產(chǎn)物并用聚丙烯酰胺膠純化,，按100nM濃度轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，另外化學(xué)合成的已知能有效抑制GAPDH表達(dá)的siRNA序列在同樣濃度下轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞作為對照,，相應(yīng)的免疫熒光圖象表明：12-15bp的降解產(chǎn)物也能夠抑制基因的表達(dá),，在相同濃度下兩種方法的抑制效果相當(dāng)。這個(gè)結(jié)果表明由RNase III制備的更短一些的siRNA混合庫能夠經(jīng)過轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞抑制靶基因的表達(dá),，似乎沒有必要通過改變反應(yīng)條件或者借助純化手段制備較長的siRNA從而抑制靶基因的表達(dá),。改變轉(zhuǎn)染的濃度，結(jié)果顯示siRNA的轉(zhuǎn)染劑量對基因抑制效果有直接影響,，RNase III制備的siRNA庫需要保持較高的濃度從而達(dá)到最大的抑制效果,，原因可能是由于：在這個(gè)siRNAs庫中既有一些有效的siRNAs分子，也有很多無效的siRNAs部分,。
Figure 2. 12-15 bp RNase III Digestion Products Elicit Silencing. A 200 bp GAPDH dsRNA (30 µg) was digested with RNase III(30 U) for 1 hour at RT. Digestion products were run on a 15% non-denaturing acrylamide gel and the 12-15 bp products were excised, eluted, and ethanol precipitated. A sample was run on a 15% non-denaturing acrylamide gel for visualization (2A). HeLa cells were transfected with 100 nM of the 12-15 bp RNase III generated GAPDH siRNAs or a 21 bp chemically synthesized GAPDH siRNA. GAPDH protein levels were monitored by immunofluorescence 48 hours after transfection (2B) and the resulting images were quantitated (2C).
基因沉默的專一性
進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這種方法制備的siRNA庫抑制靶基因表達(dá)的專一性：用RNase III制備的針對GAPDH的siRNA庫轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,，在降低GAPDH表達(dá)的同時(shí)檢測其他一系列非特異基因 (La, Ku-70, c-myc, ß-actin, and cdk-2)的表達(dá)水平，結(jié)果沒有檢測到這些非特異基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染前后的變化,。結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染RNase III制備的siRNAs庫后沒有發(fā)生非特異基因沉默,。最近一篇關(guān)于RNase III制備的siRNAs和相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白的文章同樣證實(shí)沒有非特異基因沉默的發(fā)生 (5)。在除了哺乳動物細(xì)胞以外的其他系統(tǒng)中,，可以通過Dicer酶復(fù)合物消化長片斷RNA雙鏈,，得到針對同一個(gè)靶基因多個(gè)位點(diǎn)的siRNAs群，從而特異的抑制目的基因的表達(dá),。這些結(jié)果提示存在某種適當(dāng)?shù)臋C(jī)制來維護(hù)抑制反應(yīng)的高度專一性,。
結(jié)論
用RNase III 消化dsRNA制備siRNA庫從而有效抑制目的基因表達(dá)，這是一種比較簡單粗放,、快速,、性價(jià)比很高的方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，導(dǎo)入這種方法制備的siRNA庫,，并沒有表現(xiàn)比用化學(xué)合成法制備特定的siRNAs更高的毒性或者是對基因表達(dá)的非特異效應(yīng),。采用RNase III 制備siRNAs混合庫可以避免化學(xué)合成siRNA的昂貴費(fèi)用，siRNA表達(dá)載體的繁瑣勞動,，以及為找到一個(gè)有效的siRNA 序列所必經(jīng)的漫長的篩選過程,，因而成為有別于傳統(tǒng)方法的制備siRNA的另一種好辦法，特別是對于只需要運(yùn)用RNAi 技術(shù)作為遺傳工具,，快速得到RNA干擾結(jié)果,，而無需詳細(xì)研究siRNA具體信息的研究人員更是如此。
Figure 3. RNase III siRNA Cocktails Show Specificity for Silencing. HeLa cells were transfected with 100 nM RNase III generated siRNAs to GAPDH. Immunofluorescence analysis of GAPDH, La, c-MYC, Cdk-2, Ku-90, and ß-actin was performed 48 hours post transfection and subsequently quantitated.
References
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