關(guān)鍵詞： RNAi
盡管研究基因組的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)先進(jìn),，科學(xué)家們還在致力不斷的創(chuàng)新和改造技術(shù)使之更為強(qiáng)大?，F(xiàn)代分子生物學(xué)兩個(gè)劃時(shí)代的技術(shù)——DNA芯片和RNAi (RNA-mediated interference) ，正在掀開生物醫(yī)藥的新篇章,。
RNAi,，通過雙鏈RNA引發(fā)目標(biāo)靶基因沉默的一項(xiàng)強(qiáng)大的新技術(shù)，專一性強(qiáng),，可大規(guī)模操作,，重復(fù)性高，應(yīng)用前景極為廣闊,。
另一方面,，DNA芯片技術(shù)可以提供特定條件下一個(gè)細(xì)胞中所有基因表達(dá)情況的全景圖，同樣具有無可比擬的優(yōu)勢(shì),。那么這兩種技術(shù)結(jié)合起來會(huì)怎么樣？在信號(hào)傳導(dǎo)通路研究方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，來自紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室癌癥基因組研究中心助教授Vivek Mittal, PhD,，目前正在致力于這方面的研究,。他已經(jīng)成功利用DNA芯片對(duì)癌癥和腫瘤的血管生成進(jìn)行全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄水平的分析檢測(cè)。
Mittal希望DNA芯片技術(shù)和RNAi技術(shù)結(jié)合起來,，成為更強(qiáng)大的技術(shù),，從而更系統(tǒng)深入了解整個(gè)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的完整的“全景圖”。由于采用RNAi技術(shù)可以在任何時(shí)候,，或者某一次“關(guān)閉”一個(gè)基因的表達(dá),，然后利用DNA芯片技術(shù)全面了解每次干擾的后果——關(guān)閉一個(gè)基因的表達(dá)，或者下調(diào)基因的表達(dá)水平會(huì)導(dǎo)致哪些基因表達(dá)發(fā)生哪些變化,，這樣就可以了解這個(gè)基因參與的某些信號(hào)通路的相關(guān)信息,。然后再關(guān)閉另一個(gè)基因，了解干擾的后果,，不斷的重復(fù)這樣的工作,，直到能從這些結(jié)果中總結(jié)出一個(gè)新的模式。Mittal就按照這個(gè)思路,，采用RNAi技術(shù)作為反式遺傳工具,，系統(tǒng)的干擾基因表達(dá)，然后用DNA 芯片技術(shù)了解每次干擾所引起的基因表達(dá)模式的差異來開展對(duì)血管生成調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,。
Mittal 在CSHL讀博士后的時(shí)候主要研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞中核仁小分子RNA（small nuclear RNA,，snRNA）基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，特別是轉(zhuǎn)錄如何發(fā)生的具體細(xì)節(jié),。Mittal 在研究轉(zhuǎn)錄的時(shí)候,，DNA 芯片技術(shù)方興未艾，Mittal 于是想到,，為什么要一次專注研究一個(gè)基因,，而不是在全基因組范圍內(nèi)研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控？
正好這個(gè)時(shí)候Michael Wigler在CSHL用DNA芯片研究癌癥中基因的擴(kuò)增,。Mittal 對(duì)基因的表達(dá)非常感興趣,，跟著Wigler一年，很快CSHL給Mittal 自己的實(shí)驗(yàn)室開展DNA芯片的研究,。Mittal 的實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在有幾個(gè)獨(dú)立的項(xiàng)目,，其中之一是用RNAi技術(shù)和DNA 芯片技術(shù)研究Id介導(dǎo)的血管生成通路。他們的目標(biāo)是鑒別出Id 基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中的成員,，分析它們的活性機(jī)制,，確認(rèn)它們?cè)谀[瘤生成發(fā)展過程中的產(chǎn)生的影響。他們正在系統(tǒng)的采用RNAi介導(dǎo)基因表達(dá)抑制結(jié)合DNA芯片檢測(cè)全局基因表達(dá)圖譜的方法,，將兩個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)結(jié)合起來,，再加上功能分析,，從而將Id基因調(diào)控通路的每個(gè)細(xì)節(jié)研究出來。
在腫瘤中描繪血管生成通路
這個(gè)Id轉(zhuǎn)錄因子基因家族包括Id1, Id2, Id3, 和Id4,。它們是細(xì)胞周期調(diào)控,、細(xì)胞分化等幾個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞進(jìn)程的重要調(diào)控因子，也和血管生成和一系列癌癥的失控有關(guān),。在成年人中Id1和Id3專一的在腫瘤血管內(nèi)皮中表達(dá),，Id1或者是Id3缺失的小鼠模型中腫瘤不能生長(zhǎng)或者轉(zhuǎn)移。因此,，Id和其下游目標(biāo)底物有可能成為抗血管生成藥物治療的理想目標(biāo),。
然而，說的容易做起來難,。想確定哪個(gè)特定蛋白作為用藥目標(biāo)并不是那么容易的,，所以研究人員需要先研究Id特異的信號(hào)通路來確定幾個(gè)候選蛋白。好在Id1和Id3只在腫瘤血管中表達(dá)而不會(huì)在其他正常血管中表達(dá),。
通過和其他實(shí)驗(yàn)室的合作,，Mittal的實(shí)驗(yàn)室采用 cDNA 芯片，生物信息學(xué),，RNAi技術(shù)和小鼠腫瘤模型來鑒別Id的目標(biāo)靶,，研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞中的Id 通路。他們發(fā)現(xiàn),，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞缺失Id1會(huì)導(dǎo)致a6和b4整合素,，基質(zhì)金屬蛋白酶2 (matrix metalloproteinase-2 MMP-2)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1的表達(dá)下調(diào),，同時(shí)在體內(nèi)血管生成時(shí)抑制這些因子的表達(dá)會(huì)表現(xiàn)出Id基因缺失的擬表型,。以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明這些成員可能共同參與某些傳導(dǎo)通路，比如bFGF在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)整合素a6和b4,，而MMP-2通過切割調(diào)控層粘連蛋白laminin-5（已知是a6b4 integrin的配體）來刺激表皮細(xì)胞的遷移,。
因此，如果同樣的通路確實(shí)在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮作用,，那么Id 的缺失可能會(huì)由于下調(diào)這個(gè)通路中的3種重要的成員而縮短這個(gè)通路,。這個(gè)研究展示了功能基因組學(xué)方法加上小鼠腫瘤模型如何作為一種新的手段應(yīng)用于研發(fā)抗血管生成治療藥物。他們找到了新的基因,，現(xiàn)在正在用RNAi技術(shù)對(duì)這個(gè)Id 基因網(wǎng)絡(luò)作系統(tǒng)性研究,。這種研究方法可以用在其他疾病模型的功能性分析上。
識(shí)別有效的RNAi探針
CSHL研究RNAi有一段歷史了,。有不少卓越的科學(xué)家和Mittal一起研究RNAi進(jìn)展,。Gregory Hannon教授曾經(jīng)說過“激起對(duì)RNAi如此大的興趣，正是由于RNAi確實(shí)有效”,。研究人員采用RNAi技術(shù)已經(jīng)超過2年,，這項(xiàng)技術(shù)顯然一直正常而有效的在研究系統(tǒng)中發(fā)揮作用,。
著名的《Science》雜志評(píng)選2002年重大成就時(shí)表彰了Hannon, Shiv Grewal和 Rob Martienssen教授對(duì)RNAi機(jī)制和特性的深入研究，特別是RNAi和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的非遺傳調(diào)控（epigenetic regulation）之間的關(guān)系,。但是盡管有著如此多老練的科學(xué)家在進(jìn)行研究,，RNAi還是存在不少未知的空間,。例如,，盡管RNAi是如此強(qiáng)有力的一種研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因功能的工具，但是RNAi技術(shù)一直存在一個(gè)很大的難題：顯然還缺少一種可靠的篩選RNAi靶位點(diǎn)的方法,。就是說RNAi技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的應(yīng)用,，一個(gè)難題是檢測(cè)哪種RNAi探針能夠最有效的抑制基因的表達(dá)。研究人員往往要根據(jù)一個(gè)基因不同區(qū)域制備5—6種RNAi探針,，這樣就嚴(yán)重限制了RNAi作為一種通用的基因功能分析工具在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用,。
Mittal的實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種能夠針對(duì)任意基因快速鑒別有效的小分子干擾RNA(small interfering RNAs, siRNAs)或者是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(short hairpin RNA)探針的半定量方法。這種方法包括：通過檢測(cè)RNA探針是否能夠關(guān)閉一個(gè)特殊表達(dá)的嵌合了目的基因和報(bào)告基因的mRNA中的同源序列來有效鑒別RNA探針,。通過一個(gè)熒光或者是酶類報(bào)告基因,，siRNA 的效果可以被定量檢測(cè)。Mittal的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)了多個(gè)具有不同生理功能的基因,，證實(shí)了siRNA 探針對(duì)嵌合了目的基因和報(bào)告基因的嵌合mRNA的抑制作用和對(duì)同源的內(nèi)源目的基因的抑制作用是正相關(guān)的,。
Mittal改造了一種基于微陣列的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，這種方法是以前由 Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.的科學(xué)家研究出來的,，作為高通量平行實(shí)驗(yàn)中一種篩選有效的RNAi探針的平臺(tái),。Mittal將這種基于微陣列的細(xì)胞轉(zhuǎn)染成為RNAi芯片，并證實(shí)這種方法可以進(jìn)行修改從而使之適應(yīng)高通量篩選鑒別合適的RNAi探針——將探針點(diǎn)在DNA芯片上然后在玻璃片上面直接轉(zhuǎn)染,。
制作RNAi芯片和應(yīng)用于高通量篩選RNAi探針
左圖：示意圖顯示生產(chǎn)和分析一塊RNAi芯片的過程,。兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)編碼目的基因-EGFP（加強(qiáng)型綠色熒光蛋白）融合基因,，另一個(gè)編碼RFP(紅色熒光蛋白)作為內(nèi)對(duì)照,，連同各種RNAi探針一起被點(diǎn)在芯片上，然后和哺乳動(dòng)物細(xì)胞一起培養(yǎng),，只有在最靠近DNA點(diǎn)附近的細(xì)胞會(huì)被轉(zhuǎn)染,，生長(zhǎng)成明顯不同的細(xì)胞群。用激光掃描儀進(jìn)行檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞群的EGFP和RFP的熒光強(qiáng)度,，并用分析軟件對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量,。
右上圖：激光掃描圖象顯示表達(dá)EGFP 和RFP的情況。右下圖：RNAi芯片顯示一個(gè)有效的EGFP特異的RNAi探針抑制EGFP而不是RFP的表達(dá),。一個(gè)非特異的探針不影響兩個(gè)基因的表達(dá),。結(jié)果顯示一個(gè)RNAi探針的特異性。這個(gè)方法可以用于有效的識(shí)別各種不同基因的最有效的RNAi探針,。
Mittal 認(rèn)為：鑒別出能使某個(gè)基因沉默的有效siRNA,，不僅對(duì)基礎(chǔ)研究,，同時(shí)也對(duì)基于RNAi的基因治療和遺傳工程修飾的動(dòng)物模型都將產(chǎn)生重大影響。在這個(gè)領(lǐng)域過去的兩年中,，每隔半年就有一個(gè)令人吃驚的新發(fā)現(xiàn),，人們?nèi)圆磺宄@種生理現(xiàn)象的功能和范圍。當(dāng)研究人員進(jìn)一步掌握RNAi的作用機(jī)制時(shí),，我們就可以更好的了解RNAi的限制,，同時(shí)也就能更好的設(shè)計(jì)更有效的抑制基因表達(dá)的東西。
干細(xì)胞的可塑性
深入了解干細(xì)胞在響應(yīng)微環(huán)境變化時(shí)如何決定其最終分化方向的機(jī)制也是Mittal這個(gè)小組的另一個(gè)研究課題,。他們?cè)噲D了解在分化過程中那些基因的表達(dá)發(fā)生了變化,。于是他們構(gòu)建了特殊的轉(zhuǎn)基因小鼠——小鼠的干細(xì)胞做了如下標(biāo)記：有一個(gè)由干細(xì)胞啟動(dòng)子引導(dǎo)的綠色熒光蛋白，同時(shí)干細(xì)胞中還帶有一個(gè)由分化細(xì)胞專一活性的啟動(dòng)子引導(dǎo)的紅色熒光蛋白,。通過不同的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)其熒光特征,，隨后進(jìn)行芯片分析，這將幫助解開在細(xì)胞分化過程中那些基因表達(dá)發(fā)生和,、變化是至關(guān)重要的,。鑒別不同的分化通路將使得研究人員可以在體外控制干細(xì)胞的分化。干細(xì)胞移植被認(rèn)為在減輕例如肌肉萎縮癥,，帕金森氏綜合癥和其他退行性病變的治療中有重要的應(yīng)用前景,。
有關(guān)血管生成的一些背景細(xì)節(jié)：
Vivek Mittal, 針對(duì)血管生成中Id介導(dǎo)的信號(hào)通路的研究將有助于他們進(jìn)一步開發(fā)開血管生成藥物。什么是血管生成,？這是指機(jī)體內(nèi)一個(gè)重要的自然進(jìn)程——新血管的生成,。在健康的機(jī)體內(nèi)這個(gè)進(jìn)程通常發(fā)生在各種程度的傷口愈合，通常是由一系列的開關(guān)控制,。“開”是指促進(jìn)血管生成的生長(zhǎng)因子,，“關(guān)”則主要是血管生成的抑制因子。下面是一些最新的相關(guān)研究進(jìn)展
Diseased or injured tissues produce and release angiogenic growth factors (proteins) that diffuse into the nearby tissues.
The angiogenic growth factors bind to specific receptors located on the endothelial cells of nearby preexisting blood vessels.
Once growth factors bind to their receptors, the endothelial cells become activated and signals are sent from the cell's surface to the nucleus. The endothelial cell's machinery then begins to produce new molecules including enzymes, which dissolve tiny holes in the sheath-like covering surrounding all of the existing blood vessels.
The endothelial cells divide and migrate out through the dissolved holes of the existing vessels toward the diseased tissue (tumor).
Specialized adhesion molecules, or integrins, help to pull the sprouting new blood vessels forward.
Enzymes such as matrix metalloproteinases are produced to dissolve the tissue in front of the sprouting vessel tip in order to accommodate it. As the vessel extends, the tissue is remolded around the vessel.
The sprouting endothelial cells roll up to form a blood vessel tube, which connect to form blood vessel loops that can then circulate blood.
Newly formed blood vessels are stabilized by specialized muscle cells that provide structural support and blood flow begins.
(Source: The Angiogenesis Foundation)
Name: Vivek Mittal
Title: Assistant professor, Cancer Research Genome Center, Cold Spring Harbor Laboratory
Web site: http://www.cshl.org
Education: PhD/Jawaharlal Nehru University, New Delhi, India, 1994; MS/Jawaharlal Nehru University, 1988; BS/St. Joseph's College, North Point, Darjeeling, India, 1985.
Current research: Technology development pertaining to DNA microarrays; use of DNA arrays in genome-wide analysis of cancer and tumor angiogenesis; design and implementation of informatics tools for analysis of array data.
