關(guān)鍵詞： RNAi
長(zhǎng)片斷的雙鏈RNA (dsRNA) 導(dǎo)入例如植物,，真菌，果蠅,，線蟲等生物的細(xì)胞中會(huì)引發(fā)同源mRNA的降解——這就是所謂的RNA interference (RNAi),。RNAi分兩個(gè)步驟，首先是長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNAs被核酶Dicer切割成21—25個(gè)堿基的small interfering RNAs (siRNAs),。這些siRNA隨后和相關(guān)蛋白組合成為RNA-induced silencing complex (RISC) ,，這個(gè)復(fù)合物以同源mRNA為靶摧毀mRNA。兩年前Elbashir and Tuschl用siRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中成功引發(fā)特異基因的沉默,，從此siRNA廣泛應(yīng)用于這個(gè)領(lǐng)域,。
siRNA介導(dǎo)的基因沉默通常要求高度的序列專一。Tuschl和同事證實(shí)siRNA和mRNA之間一個(gè)堿基的錯(cuò)配都會(huì)導(dǎo)致基因沉默的失敗,，當(dāng)然這并不排除由siRNAs 引發(fā)的非特異基因沉默,。siRNAs也有可能會(huì)引發(fā)一系列的部分同源的mRNAs沉默，甚至有可能象超過30個(gè)堿基的長(zhǎng)片斷dsRNA一樣通過引發(fā)抗病毒反應(yīng)—— 一種通常由于機(jī)體對(duì)抗病毒入侵產(chǎn)生的反應(yīng),，包括由蛋白激酶R和后繼的EIF2a磷酸化激活的蛋白合成阻斷,，以及由 RNase L激活的非特異RNA降解,。
這就意味著需要在全基因組范圍內(nèi)對(duì)siRNA的專一性進(jìn)行檢測(cè)。2003年5月出版的The Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Patrick Brown和同事采用DNA芯片的方法對(duì)siRNAs的專一性在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行了檢查,。
Brown和同事檢查了兩個(gè)針對(duì)外源GFP基因的siRNAs的專一性,，結(jié)論是關(guān)閉外源的GFP表達(dá)不會(huì)間接影響其他細(xì)胞內(nèi)源基因的表達(dá)水平。2個(gè)GFP特異的siRNAs和兩個(gè)隨機(jī)無(wú)意序列對(duì)照siRNAs分別被轉(zhuǎn)染能瞬時(shí)或者持續(xù)表達(dá)GFP的人源293細(xì)胞,，結(jié)果通過GFP熒光水平檢測(cè)和FACS分析,，GFP特異的siRNAs能夠沉默70%的GFP表達(dá)而對(duì)照則對(duì)GFP表達(dá)沒有影響。從轉(zhuǎn)染和沒有轉(zhuǎn)染siRNAs的細(xì)胞中分離RNA,，標(biāo)記后和點(diǎn)有36000個(gè)人類基因的cDNA 芯片雜交,。其中約有20000個(gè)基因在293細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明這20000個(gè)基因中沒有一個(gè)的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染了特異或非特異siRNAs后發(fā)生顯著變化,。（生物通按：之所以選擇針對(duì)外源基因的siRNAs來(lái)研究siRNA是否會(huì)間接影響其他內(nèi)源基因的表達(dá),，是由于關(guān)閉外源基因表達(dá)本身不會(huì)引發(fā)內(nèi)源基因表達(dá)水平的變化，某個(gè)內(nèi)源基因的表達(dá)沉默會(huì)引起整個(gè)基因相互作用網(wǎng)絡(luò)中一系列的相關(guān)基因表達(dá)模式的變化,，目前還難以判斷這種變化是由于靶基因表達(dá)沉默引起的還是由于siRNAs的非特異性引起的）
對(duì)于RNAi 特異性的另一個(gè)關(guān)注焦點(diǎn)是：傳遞的RNAi（"transitive RNAi"）或者叫'secondary siRNAs'的產(chǎn)生,。Transitive RNAi是在線蟲的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的，也可能在其他生物中發(fā)生,。在這個(gè)過程中，siRNAs,，在變性后結(jié)合到互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄本上,，通過RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase ，RdRP)在3'和5'端的延伸形成新的雙鏈dsRNAs,。這些dsRNAs被加工成為'secondary siRNAs',。這些二級(jí)siRNAs，如果和其他基因有同源,，可以導(dǎo)致其他基因表達(dá)的沉默,，這樣就強(qiáng)化了非特異基因沉默的可能性。
到目前為止,，在人類基因組中沒有發(fā)現(xiàn) RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP),，這提示在人類細(xì)胞中可能不會(huì)發(fā)生RNAi傳遞。然而這個(gè)假設(shè)并沒有被廣泛的驗(yàn)證過,。Brown和同事也檢測(cè)了在人源細(xì)胞中是否存在傳遞RNAi現(xiàn)象,。他們將兩個(gè)報(bào)告基因(luciferase and GFP)分別和常見的actin序列融合，共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中,。他們檢測(cè)到一個(gè)報(bào)告基因的特異的siRNAs不能導(dǎo)致另一個(gè)報(bào)告基因沉默,。結(jié)果表明傳遞RNAi機(jī)制在人類中不存在。
研究結(jié)果支持已有的假設(shè)：siRNAs在高度序列專一的條件下發(fā)揮作用,，只能導(dǎo)致完全互補(bǔ)的基因表達(dá)沉默,。人類細(xì)胞不存在傳遞RNAi現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)這種專一性,。
不過實(shí)驗(yàn)受限于細(xì)胞類型和siRNAs類型，特別是外源基因的siRNAs,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然有待推廣到其他細(xì)胞類型,，特別是內(nèi)源基因的siRNAs，如果siRNAs在將來(lái)要應(yīng)用于基因治療,，這樣的實(shí)驗(yàn)將尤為重要,。
References
Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, and Tuschl T (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in mammalian cell culture. Nature 411:494-498.
Elbashir SM, Martinez J, Patkaniowska A, Lendeckel W, and Tuschl T (2001). Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO 20 (23): 6877-6888.
Chi J-T, Chang HY, Wang NN, Chang DS, Dunphy N, and Brown PO (2003). Genomewide view of gene silencing by small interfering RNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (early online edition, 2 May 2003).
