于單克隆抗體,、真核細(xì)胞表達(dá)的重組制品及動物來源生物制品等病毒安全性的思考
 
  http://www.cde.org.cn 發(fā)布時(shí)間：2003/06/27 10:13:58 AM
 
關(guān)于單克隆抗體、真核細(xì)胞表達(dá)的重組制品及動物來源生物制品等病毒安全性的思考
生物制品組 羅建輝
《藥品注冊管理辦法》附件3中已明確要求“由人的,、動物的組織或者體液提取的制品、單克隆抗體及真核細(xì)胞表達(dá)的重組制品,，尚需增加病毒滅活工藝驗(yàn)證資料”,。實(shí)行《藥品注冊管理辦法》以來，經(jīng)常有研發(fā)單位咨詢上述生物制品病毒安全性及滅活/去除工藝驗(yàn)證的問題,。目前藥監(jiān)局僅發(fā)布了《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》,。還沒有制訂針對單克隆抗體、真核細(xì)胞表達(dá)的重組制品及動物來源生物制品等的病毒滅活/去除驗(yàn)證指導(dǎo)原則,。
目前已有上述生物制品在申報(bào),，研發(fā)單位對病毒的安全性問題及如何進(jìn)行滅活/去除驗(yàn)證也十分重視，經(jīng)常詢問可參考和借鑒的指導(dǎo)性文件,。為了緩解目前存在的上述現(xiàn)實(shí)矛盾,，也為了盡快起草國內(nèi)的有關(guān)指導(dǎo)原則做好前期準(zhǔn)備，我們查找了國外對該類產(chǎn)品病毒安全性及滅活/去除工藝驗(yàn)證的相關(guān)指導(dǎo)性文件,，學(xué)習(xí)了有關(guān)內(nèi)容,，將我們認(rèn)為比較重要又是急需的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了摘譯和匯總。現(xiàn)將我們的想法和基本出發(fā)點(diǎn)提出供討論交流,。
我們認(rèn)為國外對上述生物制品病毒安全性及滅活/去除驗(yàn)證的基本指導(dǎo)思想對于國內(nèi)同類制品具有借鑒價(jià)值,。但由于國外指導(dǎo)原則全文涉及的內(nèi)容比較復(fù)雜和特殊，因此難以將各方面的信息總結(jié)歸納成適合國內(nèi)具體情況的參考資料,。在此僅提出一個(gè)基本框架,，作為思考單克隆抗體、真核細(xì)胞表達(dá)的重組制品及動物來源生物制品等病毒安全性和滅活/去除驗(yàn)證工作的提示線索,。希望能夠?qū)﹃P(guān)注此事的研發(fā)人員有所啟示和幫助,。
一、 需進(jìn)行病毒滅活/去除驗(yàn)證的生物制品
主要包括：
1,、 由人或者動物來源細(xì)胞系經(jīng)體外培養(yǎng)生產(chǎn)的制品,，例如由真核細(xì)胞表達(dá)的單克隆抗體等。
2,、 由人或者動物來源組織器官/細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)的制品,，例如兔牛痘疫苗皮炎提取物等。
3,、 由人或者動物來源的尿液或者其他體液制備的生物制品,，例如尿促絨性素，小鼠腹水制備的單克隆抗體及人血液制品等
由于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)自身適宜并支持病毒的生長和繁殖,，上述生物制品基本都是從活的組織細(xì)胞或體液或發(fā)酵液/發(fā)酵物等制備,，因此污染病毒的風(fēng)險(xiǎn)很大。進(jìn)行病毒滅活/去除驗(yàn)證是保障上述制品安全性的最基本要求,。
二,、 病毒污染的主要來源
上述生物制品病毒污染的主要來源可分為：
1,、 器官、組織細(xì)胞等原材料本身固有的病毒,，例如動物組織細(xì)胞攜帶的病毒（綠猴腎細(xì)胞中的SV40病毒）,，雞胚中的禽白血病病毒等。
2,、生產(chǎn)過程中被意外引入的污染病毒,，例如細(xì)胞基質(zhì)、重組真核細(xì)胞在操作過程中被意外帶入的污染病毒,，生產(chǎn)過程中加入的動物血清等培養(yǎng)基成分帶入的病毒,，以及其他動物來源的輔料、賦形劑及生產(chǎn)人員等攜帶的病毒等,。
三,、 病毒滅活/去除驗(yàn)證的三個(gè)基本方面
病毒的滅活/去除驗(yàn)證應(yīng)考慮：
1、 種子庫細(xì)胞及其他原材料的驗(yàn)證,，包括對原始種子,、主種子及工作種子庫細(xì)胞的病毒檢測，培養(yǎng)基成分的檢測,。應(yīng)沒有可以檢測到的病毒污染（這些病毒可能對人類具有感染性或者致病性）。檢測試驗(yàn)包括逆轉(zhuǎn)錄病毒試驗(yàn)（例如用敏感細(xì)胞進(jìn)行的感染性試驗(yàn),、電鏡檢查及逆轉(zhuǎn)錄酶活性測定等）,、體外培養(yǎng)（用于檢測具有致細(xì)胞病變、血凝吸附特性的病毒）,、體內(nèi)培養(yǎng)（例如動物試驗(yàn)及雞胚試驗(yàn)用于檢測細(xì)胞培養(yǎng)不能生長的病毒）及抗體產(chǎn)生試驗(yàn)（用于檢測種屬特異性病毒）,。
2、 生產(chǎn)工藝驗(yàn)證,，主要包括重要生產(chǎn)工藝步驟對人為加入的指示病毒在模擬的生產(chǎn)條件下其滅活/去除效能的驗(yàn)證,。
3、 生產(chǎn)工藝關(guān)鍵階段抽樣產(chǎn)品的驗(yàn)證,，主要針對不同階段產(chǎn)品去除/滅活病毒效果的檢測,，例如通過對未經(jīng)處理的培養(yǎng)結(jié)束時(shí)收獲的原液檢測（根據(jù)實(shí)際情況可選擇檢測細(xì)胞培養(yǎng)的上清液、完整細(xì)胞,、破碎的細(xì)胞或者后兩種的混合物）可以了解培養(yǎng)過程有無外源病毒的污染,，對終產(chǎn)品的檢測可以了解工藝對病毒清除的最終實(shí)際效果。
上述三個(gè)方面互為補(bǔ)充,，不可相互替代,，應(yīng)綜合考慮。在聯(lián)合使用的情況下,，能增加對病毒滅活/去除效果的可信度,，降低產(chǎn)品病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)性,。但由于每個(gè)制品本身及生產(chǎn)工藝方面的特殊性，加之未知病毒對人體構(gòu)成的潛在安全性隱患目前尚不清楚等原因,，因此應(yīng)結(jié)合品種的特點(diǎn)例如產(chǎn)品的類型,、臨床用途、給藥途徑等按個(gè)性化處理,，但必須能夠?yàn)椴扇〉牟《緶缁?去除方法,、實(shí)際效果及病毒安全性問題提供充分的試驗(yàn)依據(jù)和理由。
四,、 指示病毒/模擬病毒的選擇
應(yīng)首先選擇與產(chǎn)品中可能污染病毒類似的指示病毒/模擬病毒,，其次指示病毒/模擬病毒應(yīng)盡可能代表廣泛的物理化學(xué)特性以驗(yàn)證系統(tǒng)總體清除病毒的應(yīng)對效能。應(yīng)注意選擇的實(shí)驗(yàn)毒株與自然毒株及其他毒株之間可能存在的的差異,，在其他方面相同的前提下應(yīng)優(yōu)先考慮抵抗力強(qiáng)的毒株,。
總之，應(yīng)選擇適合于具體產(chǎn)品特性及工藝特點(diǎn)的指示病毒/模擬病毒,，同時(shí)應(yīng)考慮選擇敏感,、可靠及有效的相應(yīng)檢測方法（比如感染性試驗(yàn)方法）。對于來源于綿羊,、山羊或牛源性的制品應(yīng)關(guān)注BSE的問題,，可參照其他有關(guān)BSE的要求和規(guī)定。
五,、 驗(yàn)證性研究的設(shè)計(jì)思考
選擇關(guān)鍵性工藝步驟,，人為加入選擇的指示病毒/模擬病毒，通過檢測每一步驟對加入病毒的去除/滅活的實(shí)際程度來評價(jià)工藝的清除效能,。在遵守GLP規(guī)范的前提下,，根據(jù)縮小的模擬工藝條件在適宜的病毒操作試驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。注意縮小的工藝與實(shí)際工藝之間的可比性及其他對清除效果有重要影響的附加條件,。應(yīng)盡可能明確病毒感染性的降低是由于滅活還是去除作用的結(jié)果,。在試驗(yàn)中應(yīng)加入適宜的對照質(zhì)控以排除干擾性因素，并建立方法學(xué)的最低檢測量,。建議采用具有足夠的敏感性和重復(fù)性的定量感染性試驗(yàn)（比如TCID50方法）進(jìn)行多孔平行對照檢測,，以保證試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的準(zhǔn)確性?？梢圆捎肞CR檢測方法但應(yīng)注意對PCR方法學(xué)本身的驗(yàn)證,，同時(shí)考慮PCR試驗(yàn)只能檢測病毒核酸特定區(qū)域而不能區(qū)分測定的樣本是否有感染性的特性。
六,、 對檢測結(jié)果的解釋及驗(yàn)證研究的局限性
有關(guān)對驗(yàn)證檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,、正確理解和解釋以及驗(yàn)證研究的局限性等問題可參見《血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》的有關(guān)內(nèi)容。
以上意見包括了個(gè)人觀點(diǎn),，僅供申報(bào)者參考,。同時(shí),，我們也真誠地希望能聽到各方面的反饋意見，以便使我們及時(shí)修正不恰當(dāng)?shù)挠^點(diǎn)和看法,，從而使我們的審評更科學(xué),、更合理。

參考文獻(xiàn)：
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