表達(dá)不同于其它一些實驗,，比如：提取質(zhì)粒、PCR,、電鏡切片,，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析,。表達(dá)呢,，你把質(zhì)粒克隆好,，交給細(xì)胞,，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達(dá)在表達(dá)當(dāng)中來說還是比較簡單,，細(xì)菌培養(yǎng)條件簡單,、生長速度快，需要的儀器和培養(yǎng)基都比較便宜,。當(dāng)然,，它也存在一些缺乏高級修飾、細(xì)胞內(nèi)部還原性過高等缺點,。
原核表達(dá)從一開始的設(shè)計就非常重要,，所謂好的開始是成功的一半。做足準(zhǔn)備功夫,，可是省去很多將來后悔的事情,。首先，我們要根據(jù)是否要求可溶將載體分成兩大類,，如果希望可以同時嘗試多種表達(dá)系統(tǒng),，也有許多商業(yè)化的系統(tǒng)供選擇。
先從蛋白分析講起：同樣的載體,、同樣的系統(tǒng),，很可能表達(dá)這個蛋白表達(dá)量奇高，但是另外一個就是做不出來,，所以沒有萬能的載體,，只有永恒的分析,。當(dāng)然如果你的蛋白曾經(jīng)在原核系統(tǒng)中成功表達(dá)出來那是最好的，選擇同樣的載體表達(dá)成功率會高很多,。如果沒有也最好嘗試找一些曾經(jīng)表達(dá)過和你的蛋白擁有相類似結(jié)構(gòu)的文獻(xiàn),。比如大部分含有哺乳動物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列載體表達(dá)出來的。根據(jù)經(jīng)驗而言,，含有較少半胱氨酸和脯氨酸的,、平均大小為60kD的單體蛋白較容易表達(dá)。
在下面將列出幾個影響表達(dá)的因素,，大家可以在表達(dá)前根據(jù)這幾個因素自己分析一下：
1,、翻譯起始位點
現(xiàn)在大部分的表達(dá)載體都提供起始位點，所以它已經(jīng)把起始密碼子與核糖體結(jié)合位點的距離進(jìn)行優(yōu)化了,，一般情況下不需要自己再加,，不過還是要留意載體圖譜上是否注明有起始密碼子和終止密碼子
2、GC含量
表達(dá)序列中的GC含量超過70％的時候可能會降低蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平,。GC含量可以利用DNA STAR,、Vector NTI Suite等軟件進(jìn)行預(yù)測,。
3,、二級結(jié)構(gòu)
在起始密碼子附近的mRNA二級結(jié)構(gòu)可能會抑制翻譯的起始或者造成翻譯暫停從而產(chǎn)生不完全的蛋白。如果利用軟件分析DNA或RNA結(jié)構(gòu)上有柄（stem）結(jié)構(gòu),，并且結(jié)合長度超過8個堿基,，這種結(jié)構(gòu)會因為位點專一突變等因素而變得不穩(wěn)定。
4,、基因或者蛋白的大小
一般說來小于5kD或者大于100kD的蛋白都是難以表達(dá)的,。蛋白越小，越容易被降解,。在這種情況下可以采取串聯(lián)表達(dá),，在每個表達(dá)單位（即單體蛋白）間設(shè)計蛋白水解或者是化學(xué)斷裂位點。如果蛋白較小,，那么加入融合標(biāo)簽GST,、Trx、MBP或者其它較大的促進(jìn)融合的蛋白標(biāo)簽就較有可能使蛋白正確折疊,，并以融合形式表達(dá),。
對于另一個極端，大于60kD的蛋白建議使用較小的標(biāo)簽,，如6×組氨酸標(biāo)簽,。對于結(jié)構(gòu)研究較清楚的蛋白可以采取截取表達(dá)。當(dāng)然表達(dá)時要根據(jù)目的進(jìn)行截取,，如果是要進(jìn)行抗體制備而截取,，那么一定要保證截取的部位抗原性較強,。對于抗原性也可以利用軟件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在線軟件,，不過在分析之余也要認(rèn)識到這是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的結(jié)論,，如果蛋白和免疫動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的話還是不妨一試的。
5,、親疏水性
這也是一種經(jīng)驗之談,，相信經(jīng)常做表達(dá)的人都發(fā)現(xiàn)表達(dá)親水區(qū)域時表達(dá)量會比較高，如果你要表達(dá)一個膜蛋白,，那么勸你做好長期抗戰(zhàn)的準(zhǔn)備吧,。有許多軟件可以對氨基酸的親疏水性進(jìn)行分析，比如Vector
NIT Suite,，除此之外還可以利用在線跨膜區(qū)預(yù)測軟件對跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測,。
對于自己表達(dá)的蛋白有所了解后就可以開始對載體進(jìn)行選擇了，目前商業(yè)化的載體基本上包含以下幾個元件：除了上面標(biāo)出的元件外還需要有復(fù)制起點,，它對于控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)非常重要,；另外就是篩選標(biāo)記了，比如藍(lán)白斑篩選的lacZ,，各種抗生素標(biāo)記,。在以上幾個元件中，我們需要注意的是負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)與啟動的元件,，也就是調(diào)控子和啟動子,。其中啟動子對于蛋白表達(dá)的速度起著舉足輕重的作用，它與最終蛋白的表達(dá)量,、是否可融密不可分,。這里，對于世面上廣泛銷售的幾種原核表達(dá)載體使用的啟動子進(jìn)行總結(jié)
啟動子來源
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