1LAMP技術(shù)的進展
1.1檢測反應(yīng)的加速提高檢測反應(yīng)的速度,，縮短病原檢測用時對于疾病的快速診斷和對癥治療具有重要意義。
Nagamin,。等發(fā)現(xiàn)在LAMP反應(yīng)體系中增加2條與擴增產(chǎn)物莖環(huán)結(jié)構(gòu)互補的環(huán)引物能夠有效地提高擴增反應(yīng)速度,，顯著縮短檢測反應(yīng)時間。Tanner等「31在多重LAMP技術(shù)的研究中使用Bst2.0DNA聚合酶替代傳統(tǒng)的BstDNA聚合酶,，實驗結(jié)果顯示能夠縮短約50%的檢測時間,。新一代聚合酶是通過對BstDNA聚合酶進行大量計算模擬優(yōu)化之后推出的，具有酶促反應(yīng)更快,，產(chǎn)量更高,，對緩沖體系耐受能力更廣，熱穩(wěn)定性更好的優(yōu)點,。這些研究和應(yīng)用增強了LAMP技術(shù)在疾病快速檢測的應(yīng)用潛力,。
1.2L檢測反應(yīng)結(jié)果判讀的可視化早期的LAMP實驗結(jié)果的判讀方法與PCR相同，均為對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,、嗅化乙吮染色進行判斷,。Mori等〔發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)在合成DNA的同時伴有副產(chǎn)物焦磷酸根離子生成并與反應(yīng)緩沖液中的Mgz+離子結(jié)合生成不溶于水的焦磷酸鎂，反應(yīng)后對產(chǎn)物進行離心能夠使沉淀更為明顯可見,，便于肉眼判讀實驗結(jié)果;對焦磷酸鎂的產(chǎn)量和反應(yīng)合成DNA的產(chǎn)量之間的關(guān)系進行研究,，結(jié)果顯示二者的產(chǎn)量呈線性相關(guān)。Iwamoto等[s〕在反應(yīng)完成后加人SYBRGreenI熒光染料,，能與雙鏈DNA分子結(jié)合,，通過觀察擴增產(chǎn)物溶液是否從橘黃變?yōu)榫G色來判斷實驗結(jié)果。熒光染料顯色方法靈敏度高,，但反應(yīng)結(jié)束后添加染料的操作容易造成產(chǎn)物氣溶膠擴散,，引起后續(xù)相關(guān)實驗出現(xiàn)假陽性。Boehme等在配制反應(yīng)體系時加人指示劑鈣黃綠素,，擴增反應(yīng)產(chǎn)生的焦磷酸根離子與金屬離子結(jié)合降低了緩沖液的金屬離子濃度使得鈣黃綠素轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x狀態(tài),，在紫外光照射下發(fā)出綠色熒光。反應(yīng)結(jié)束后只需紫外燈照射便可讀取實驗結(jié)果,，避免實驗室環(huán)境污染,。Tomit。等〔}l對鈣黃綠素顯色法進行了改進,，在反應(yīng)體系添加MnCh使得鈣黃綠素顯色反應(yīng)在可見光下也可以觀察,，通過肉眼觀察擴增產(chǎn)物溶液是否從淺黃色變?yōu)榫G色來判斷實驗結(jié)果。Goto等「8〕引入了另一種金屬離子指示劑經(jīng)基蔡酚藍,，通過對Mgz+離子濃度變化進行監(jiān)測:反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀造成了Mgz十離子濃度降低,，經(jīng)基蔡酚藍指示劑發(fā)生相應(yīng)的顏色變化，反應(yīng)結(jié)束后以在可見光下觀察溶液是否由紫色變?yōu)樘焖{色作為結(jié)果判斷的依據(jù)。鈣黃綠素和經(jīng)基蔡酚藍顯色法的應(yīng)用,，優(yōu)點在于檢測結(jié)果可以在可見光下觀察反應(yīng)前后溶液顏色變化來判讀實驗結(jié)果,，不會造成實驗室污染并降低了儀器需求，使之更適于現(xiàn)場以及儀器配置不足的城鎮(zhèn)級別醫(yī)院,、疾控中心進行病原檢測工作,。
