創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)軟骨缺損及骨關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床常見疾患,其臨床治療是一個(gè)難題細(xì)胞生物學(xué)和生物材料技術(shù)的發(fā)展,使得應(yīng)用組織工程成為了修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的新方法Marcacci等2{認(rèn)為,應(yīng)用組織工程可以修復(fù)4cm-以上的關(guān)節(jié)軟'r}·缺損.}C'}11等f3應(yīng)用膠原支架構(gòu)建的組織工程軟骨治療了2g例膝關(guān)節(jié)大面積全層軟骨缺損患者,2年后癥狀明顯改善,復(fù)查關(guān)節(jié)鏡發(fā)現(xiàn)優(yōu)良率達(dá)93/C.然而,組織工程軟骨移植時(shí)固定困難,、愈合慢,、移植物易脫落,組織工程軟骨與宿主軟骨之間的整合不良是阻礙組織工程軟骨臨床推廣應(yīng)用的瓶頸.我們以軟骨細(xì)胞和聚乳酸聚輕基乙酸聚合物(PLGA)支架構(gòu)建高質(zhì)量的組織工程軟骨,成骨細(xì)胞和磷酸三鈣(TCP)支架構(gòu)建組織工程骨,縫合成骨軟骨復(fù)合體,修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損,探討自體組織工程骨軟骨復(fù)合體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性,評價(jià)修復(fù)效果.
材料與方法
1.材料:小型豬(1個(gè)月齡,泰州小型豬培育基地),DMFM/F12培養(yǎng)基(美國(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季清公司),胰蛋白酶(美國Gibe.公司),n型膠原酶(美國Gibe.公司),Percoll分離液(美國Sigma公司),多聚賴氨酸(美國Sigma公司),hr_c}無紡網(wǎng)支架(_L海易括公司),n型膠原單克隆抗體(美國Calhiocheir公司),1,9一二甲基亞甲藍(lán)(美國Sigma公司),硫酸軟骨素(美國Sigma公司).
2.實(shí)驗(yàn)分組:A組(實(shí)驗(yàn)組):組織工程骨軟骨復(fù)合體組;B組(對照組):單純工程軟骨;C組(空白組):軟骨缺損不作處理.1個(gè)月齡小型豬18頭分別編號,隨機(jī)分入各組.
3.豬關(guān)節(jié)軟骨的分離與擴(kuò)增:取A組及B組小型豬,無菌條件下分離膝關(guān)節(jié)軟骨,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,剪成約1mm3大小,0.25%胰酶37℃消化30min后,棄上清加人0.2%且型膠原酶37°C消化4h,分別用150目和200目濾網(wǎng)過濾,濾液1000r/min離心5min,收集細(xì)胞.錐蟲藍(lán)拒染法細(xì)胞活性計(jì)數(shù)≥%%,原代細(xì)胞以5×1oVL接種于藥cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng).每3d換液1次,待細(xì)胞9O%融合后,按1:3傳代,至第2代末各用.
4.豬成骨細(xì)胞細(xì)胞的分離與擴(kuò)增:取A組小型豬,無菌條件下分離膝關(guān)節(jié)干骺端松質(zhì)骨,操作同軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)
5支架處理:將PLGA支架剪成直徑4mm×2mm大小,將TCP支架打磨成直徑4mm×3mm大小,分別浸泡無菌10%多聚賴氨酸,環(huán)氧乙烷消毒后各用:
6.細(xì)胞的接種與培養(yǎng):分別收獲軟骨細(xì)胞和成骨紳胞,調(diào)整密度至4×1o1VL,取z個(gè)支架,置于6孔培養(yǎng)板內(nèi),每個(gè)支架緩慢滴加旬Itl細(xì)胞懸液,將支架移人37°C,5%c02的培養(yǎng)箱靜置4h,每孔加21nl培養(yǎng)液.1d后加足量培養(yǎng)液,隔日換液,培養(yǎng)2周.
7.骨軟骨復(fù)合體的構(gòu)建:將A組相同編號的組織工程軟骨及組織程骨,以可吸收線籌合固定成復(fù)合體.
8.分組手術(shù):每次實(shí)驗(yàn)各組取1頭小型豬,以C,、B、A為序,依次手術(shù).以氯胺酮肌注,戊巴比妥鈉靜脈維持麻醉.常規(guī)消毒一側(cè)膝關(guān)節(jié),取膝關(guān)節(jié)前方正中切口切開皮膚皮下及筋膜,外翻髕骨,暴露股骨髁.以4mm環(huán)鉆于股骨髁負(fù)重面做軟骨缺損.c組關(guān)閉傷口.B組植人相應(yīng)編號的組織I程軟骨,用可吸收線固定于周圍軟骨,關(guān)閉傷口.A組以環(huán)鉆加深缺損,嵌人相應(yīng)編號的組織ェ程骨軟骨復(fù)合體,關(guān)閉傷口.6個(gè)月后取材檢測.
9.大體標(biāo)本觀察:取出各實(shí)驗(yàn)膝關(guān)節(jié),肉眼觀察缺損處修復(fù)情況,包括修復(fù)組織的形態(tài),、色澤、表面光滑度,、組織彈性D縱行切卉標(biāo)本,切面觀察修復(fù)處組織的形態(tài)以及與周圍組織的結(jié)合情況.
10.組織學(xué)觀察:標(biāo)本切片分別用蘇木素-伊紅(HE)染色,II型膠原免疫組織化學(xué)染色鏡下觀察.應(yīng)用Im鴨c~p∞p抵6.o圖像分析系統(tǒng)對II型膠原免疫組織化學(xué)染色切片行II型膠原染色面積半定量分析.
11.氨基糖胺聚糖(GAG)含量檢測:取標(biāo)本,冷凍干燥.用1,9二甲基亞甲藍(lán)法測定GAG含量.標(biāo)準(zhǔn)品為硫酸軟骨素.
12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示9應(yīng)用S°Cs13,0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各組之間比較采用單囚素方差分析,各組之間兩兩比較采用g檢驗(yàn).
結(jié)果
1,大體標(biāo)本觀察:A組缺損修復(fù)組織呈軟骨樣,表面光滑平坦,有彈性,有光澤,剖面觀與周圍軟骨整合良好:B組修復(fù)組織呈纖維組織,表面高低起伏,彈性及光澤欠佳,與周圍組織整合欠佳.c組缺損仍明顯,軟骨損傷區(qū)不規(guī)則擴(kuò)大.
2.HE染色組織學(xué)觀察A組軟骨細(xì)胞增殖最旺盛,排列緊密,分布均勻,細(xì)胞被大量細(xì)胞外基質(zhì)包圍,融合成片,可見軟骨陷窩,和周圍組織整合緊密;B組次之;C組軟骨細(xì)胞增殖最差,分布散亂,細(xì)胞外基質(zhì)較少,未見融合成片.
3.Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察:.各組有Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)陽性染色A組棕黃色面積最大,顏色最深分布均勻:B組次之;C組棕黃色面積最小,顏色最淺,分布不均勻_應(yīng)用Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)對11型膠原染色面積進(jìn)行半定量分析(表1)方差分析顯示各組染色面積之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步做各組之間兩兩比較y檢驗(yàn)顯示:A組>B組>C組.
4.GAG含量結(jié)果比較:各組標(biāo)本GAG含量結(jié)果見表1,方差分析顯示各組GAG含量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步做各組之間兩兩比較q檢顯示:A組>B組>C組.
材料與方法
1.材料:小型豬(1個(gè)月齡,泰州小型豬培育基地),DMFM/F12培養(yǎng)基(美國(Gibco公司),胎牛血清(杭州四季清公司),胰蛋白酶(美國Gibe.公司),n型膠原酶(美國Gibe.公司),Percoll分離液(美國Sigma公司),多聚賴氨酸(美國Sigma公司),hr_c}無紡網(wǎng)支架(_L海易括公司),n型膠原單克隆抗體(美國Calhiocheir公司),1,9一二甲基亞甲藍(lán)(美國Sigma公司),硫酸軟骨素(美國Sigma公司).
2.實(shí)驗(yàn)分組:A組(實(shí)驗(yàn)組):組織工程骨軟骨復(fù)合體組;B組(對照組):單純工程軟骨;C組(空白組):軟骨缺損不作處理.1個(gè)月齡小型豬18頭分別編號,隨機(jī)分入各組.
3.豬關(guān)節(jié)軟骨的分離與擴(kuò)增:取A組及B組小型豬,無菌條件下分離膝關(guān)節(jié)軟骨,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次,剪成約1mm3大小,0.25%胰酶37℃消化30min后,棄上清加人0.2%且型膠原酶37°C消化4h,分別用150目和200目濾網(wǎng)過濾,濾液1000r/min離心5min,收集細(xì)胞.錐蟲藍(lán)拒染法細(xì)胞活性計(jì)數(shù)≥%%,原代細(xì)胞以5×1oVL接種于藥cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng).每3d換液1次,待細(xì)胞9O%融合后,按1:3傳代,至第2代末各用.
4.豬成骨細(xì)胞細(xì)胞的分離與擴(kuò)增:取A組小型豬,無菌條件下分離膝關(guān)節(jié)干骺端松質(zhì)骨,操作同軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)
5支架處理:將PLGA支架剪成直徑4mm×2mm大小,將TCP支架打磨成直徑4mm×3mm大小,分別浸泡無菌10%多聚賴氨酸,環(huán)氧乙烷消毒后各用:
6.細(xì)胞的接種與培養(yǎng):分別收獲軟骨細(xì)胞和成骨紳胞,調(diào)整密度至4×1o1VL,取z個(gè)支架,置于6孔培養(yǎng)板內(nèi),每個(gè)支架緩慢滴加旬Itl細(xì)胞懸液,將支架移人37°C,5%c02的培養(yǎng)箱靜置4h,每孔加21nl培養(yǎng)液.1d后加足量培養(yǎng)液,隔日換液,培養(yǎng)2周.
7.骨軟骨復(fù)合體的構(gòu)建:將A組相同編號的組織工程軟骨及組織程骨,以可吸收線籌合固定成復(fù)合體.
8.分組手術(shù):每次實(shí)驗(yàn)各組取1頭小型豬,以C,、B、A為序,依次手術(shù).以氯胺酮肌注,戊巴比妥鈉靜脈維持麻醉.常規(guī)消毒一側(cè)膝關(guān)節(jié),取膝關(guān)節(jié)前方正中切口切開皮膚皮下及筋膜,外翻髕骨,暴露股骨髁.以4mm環(huán)鉆于股骨髁負(fù)重面做軟骨缺損.c組關(guān)閉傷口.B組植人相應(yīng)編號的組織I程軟骨,用可吸收線固定于周圍軟骨,關(guān)閉傷口.A組以環(huán)鉆加深缺損,嵌人相應(yīng)編號的組織ェ程骨軟骨復(fù)合體,關(guān)閉傷口.6個(gè)月后取材檢測.
9.大體標(biāo)本觀察:取出各實(shí)驗(yàn)膝關(guān)節(jié),肉眼觀察缺損處修復(fù)情況,包括修復(fù)組織的形態(tài),、色澤、表面光滑度,、組織彈性D縱行切卉標(biāo)本,切面觀察修復(fù)處組織的形態(tài)以及與周圍組織的結(jié)合情況.
10.組織學(xué)觀察:標(biāo)本切片分別用蘇木素-伊紅(HE)染色,II型膠原免疫組織化學(xué)染色鏡下觀察.應(yīng)用Im鴨c~p∞p抵6.o圖像分析系統(tǒng)對II型膠原免疫組織化學(xué)染色切片行II型膠原染色面積半定量分析.
11.氨基糖胺聚糖(GAG)含量檢測:取標(biāo)本,冷凍干燥.用1,9二甲基亞甲藍(lán)法測定GAG含量.標(biāo)準(zhǔn)品為硫酸軟骨素.
12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示9應(yīng)用S°Cs13,0統(tǒng)計(jì)軟件分析,各組之間比較采用單囚素方差分析,各組之間兩兩比較采用g檢驗(yàn).
結(jié)果
1,大體標(biāo)本觀察:A組缺損修復(fù)組織呈軟骨樣,表面光滑平坦,有彈性,有光澤,剖面觀與周圍軟骨整合良好:B組修復(fù)組織呈纖維組織,表面高低起伏,彈性及光澤欠佳,與周圍組織整合欠佳.c組缺損仍明顯,軟骨損傷區(qū)不規(guī)則擴(kuò)大.
2.HE染色組織學(xué)觀察A組軟骨細(xì)胞增殖最旺盛,排列緊密,分布均勻,細(xì)胞被大量細(xì)胞外基質(zhì)包圍,融合成片,可見軟骨陷窩,和周圍組織整合緊密;B組次之;C組軟骨細(xì)胞增殖最差,分布散亂,細(xì)胞外基質(zhì)較少,未見融合成片.
3.Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察:.各組有Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)陽性染色A組棕黃色面積最大,顏色最深分布均勻:B組次之;C組棕黃色面積最小,顏色最淺,分布不均勻_應(yīng)用Image-proplus6.0圖像分析系統(tǒng)對11型膠原染色面積進(jìn)行半定量分析(表1)方差分析顯示各組染色面積之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步做各組之間兩兩比較y檢驗(yàn)顯示:A組>B組>C組.
4.GAG含量結(jié)果比較:各組標(biāo)本GAG含量結(jié)果見表1,方差分析顯示各組GAG含量之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),進(jìn)一步做各組之間兩兩比較q檢顯示:A組>B組>C組.
