輸血是臨床搶救和治療患者的重要手戥之一,但也具有傳染疾病的危險(xiǎn)。血液成分中傳播病毒危險(xiǎn)性最大的是白細(xì)胞,其次為血漿,因此對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活并濾除白細(xì)胞成為保障輸血安全的主要措施之一,。目前,我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活,常用方法是亞甲藍(lán)光化學(xué)法(methylenebluephot°chem“try,MBP),該方法在歐洲國(guó)家中應(yīng)用較為普遍[I],是我國(guó)目前唯一獲準(zhǔn)用于臨床的光化學(xué)血漿病毒滅活技術(shù),。M⒊P幾乎可滅活所有細(xì)胞外的脂質(zhì)包膜病毒,但對(duì)細(xì)胞內(nèi)的病毒不具各滅活作用,因此采用MBP滅活血漿病毒的同時(shí),還要對(duì)血漿中的白細(xì)胞進(jìn)行濾除[2]。M⒊P在病毒滅活過程中對(duì)血液成分的結(jié)構(gòu)和功能可能有一定的影響,Williamson等[3]總結(jié)了多項(xiàng)研究中亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活對(duì)血漿成分的影響,、凝血因子等的活性減少可達(dá)4%~32%,。為了解常規(guī)工作流程下病毒滅活血漿中主要凝血因子等的狀況,研究病毒滅活過程對(duì)血液質(zhì)量的影響,現(xiàn)對(duì)病毒滅活前后的血漿進(jìn)行抽樣檢測(cè),報(bào)告如下。
材料與方法
1 標(biāo)本來源均來源于淮北市中心血站⒛13年6月無償獻(xiàn)血血液標(biāo)本,隨機(jī)抽取應(yīng)用去白細(xì)胞四聯(lián)袋采集的30份400ml全血,利用采血后6h內(nèi)的制各新鮮血漿,在百級(jí)凈化間內(nèi)無菌連接血漿袋和病毒滅活過濾器,使血漿緩慢通過MB添加元件,血漿中亞甲藍(lán)終濃度為1um,。l/L,將含有亞甲藍(lán)的血漿流入病毒滅活耗材的一個(gè)空袋中,混勻后留樣10ml備檢,。然后將加人亞甲藍(lán)的血漿置4C病毒滅活箱的擱架上,擺動(dòng)頻率60次/mlll,利用30000~35000LX光照強(qiáng)度的可見光照射30min,將光照后的血漿通過病毒滅活過濾器濾除殘余的亞甲藍(lán)和白細(xì)胞,混勻后留樣10ml備檢。
2 主要儀器與試劑四聯(lián)采血袋(山東威高醫(yī)用品股份有限公司,批號(hào)1304282),含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋(上海輸血技術(shù)有限公司,批號(hào)130307),凝血因子Ⅱ、V,、Ⅶ,、Ⅷ、Ⅸ,、X,、Ⅺ、Ⅻ活性和纖維蛋白原(Fg)含量的測(cè)定試劑盒(SIEMENS,批號(hào)546553A),總蛋白(TP)試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所,批號(hào)20130405),6000I離心機(jī)(德國(guó)賀利氏),DXZⅡ型低溫操作臺(tái)(鄭州飛龍醫(yī)療設(shè)各有限公司),CA50全自動(dòng)血凝儀(日本Sysmex公司),HDME1A型醫(yī)用血漿病毒滅活柜(上海輸血技術(shù)有限公司),。
3 凝血因子和總蛋白含量的檢測(cè)凝血因子Ⅱ、V,、Ⅶ,、Ⅷ、Ⅸ,、X,、Ⅺ、Ⅻ的活性及Fg含量測(cè)定采用血凝儀,TP含量測(cè)定采用雙縮脲法,嚴(yán)格依據(jù)檢測(cè)試劑說明書操作,。
4 白細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)·291·數(shù),。白細(xì)胞濾除率=(濾除前血漿白細(xì)胞數(shù)-濾除后血漿白細(xì)胞數(shù))/濾除前血漿白細(xì)胞數(shù)×100%。
5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Ⅰ±s)表示,處理前后各指標(biāo)的比較采用配對(duì)矽檢驗(yàn),。
結(jié)果
1 對(duì)血漿中凝血因子的影響經(jīng)亞甲藍(lán)光化學(xué)法處理30min后,血漿中凝血因子活性在處理后均有不同程度的損傷,多數(shù)在80%以上,。血漿凝血因子V和Ⅷ活性減少明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他凝血因子活性減少不明顯(P<0.05),
2 對(duì)血漿Fg和TP含量的影響血漿中Fg含量【g/L)下降了8.02%,TP含量(g/I')僅下降了3.91%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),
3 白細(xì)胞濾除效果白細(xì)胞濾除前新鮮血漿含有白細(xì)胞數(shù)為(5.72±1.56)×106個(gè)/U,白細(xì)胞濾過和亞甲藍(lán)光照處理后新鮮血漿白細(xì)胞殘留量(1.14±0.37)×104個(gè)/U(″=30),白細(xì)胞去除率>99.80%。
討論
MBP是一種安全,、有效,適用于單袋血漿病毒滅活的方法:l,M⒊P在滅活病毒的同時(shí)可能對(duì)凝血因子和蛋白有一定的負(fù)面作用,造成血漿有效成分的損失[5],。本次研究表明,血漿病毒滅活前、后有效成分的含量發(fā)生改變,。M⒊P可使血漿中的凝血因子含量降低,對(duì)穩(wěn)定凝血因子及血漿蛋白影響不大,。血漿凝血因子FⅡ、FⅦ,、FⅨ,、FX、FⅪ和FⅪ的回收率分別為91.11%,、91.08%,、89.14%、92.63%,、90.79%和93.60%,血漿Fg和TP回收率分別為91.98%和96.39%,病毒滅活前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。不穩(wěn)定的凝血因子FⅤ和FⅧ活性明顯降低,回收率分別為84.19%和82.56%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍在國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)(新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.7IU/ml;病毒滅活新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.5IU/ml)。其主要原因是FⅧ,、Fv屬不穩(wěn)定凝血因子,離體后受外界的溫度及離體時(shí)間的影響,外界溫度越高,離體時(shí)間越長(zhǎng),含量或活性下降越明顯,。另一方面,亞甲藍(lán)在可見光照射時(shí)產(chǎn)生的自由基(一類機(jī)制),或單線態(tài)氧(二類機(jī)制)氧化損傷病毒分子結(jié)構(gòu)使其核酸斷裂,、復(fù)制終止的同時(shí),也對(duì)血漿一些蛋白成分造成損傷[6]。文獻(xiàn)[7’引認(rèn)為光照強(qiáng)度30000Lux,、光照時(shí)間30min,溫度(4±2)C的MBP處理?xiàng)l件既可有效滅活病毒又對(duì)凝血因子活性改變影響最小,該條件對(duì)外源性凝血系統(tǒng)影響不大,但對(duì)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)(主要是FⅧ)有一定影響,。馬改娣等[9□也證實(shí)經(jīng)亞甲藍(lán)滅活后血漿FⅧ:C和Fv:C比滅活前活性均明顯降低,與本次研究結(jié)果基本相同。實(shí)驗(yàn)所用的MBP血漿病毒滅活方法不僅破壞了病毒穿透,、復(fù)制及感染能力,抑制了病毒的傳播,同時(shí)還濾除了血漿中殘留的白細(xì)胞,。血制品中殘留白細(xì)胞含量與輸血安全性密切相關(guān)。白細(xì)胞內(nèi)不僅含有潛在的致病因子,同時(shí)還與非溶血性發(fā)熱反應(yīng),、HI冫A同種免疫,、血小板輸注無效等疾病相關(guān)。研究表明:一般每單位血漿中殘余白細(xì)胞的數(shù)量約為105~107,濃度雖不高,但仍可導(dǎo)致與白細(xì)胞相關(guān)的輸血不良反應(yīng),更重要的是可攜帶如巨細(xì)胞病毒(CMV),、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型(HTLVI),、皰疹病毒(HTV)等輸血相關(guān)病毒[lO]。由于白細(xì)胞在血制品保存過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)無法用白細(xì)胞濾器濾除,所以保存前給予濾除,既可以減少由白細(xì)胞數(shù)量和相關(guān)代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的不良輸血反應(yīng),也可避免由親白細(xì)胞病毒,、微生物等傳染性病原體導(dǎo)致的血源性感染,。因此各國(guó)對(duì)血制品中殘留白細(xì)胞的含量均有嚴(yán)格的限定,。歐洲現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是每個(gè)血制品包裝中應(yīng)少于1×106個(gè)白細(xì)胞,。M⒊P法中的白細(xì)胞濾除屬于儲(chǔ)存前過濾,因?yàn)樵?~72h內(nèi)過濾血液,白細(xì)胞沒有破碎,也未釋放出細(xì)胞因子,經(jīng)MBP滅活的血漿白細(xì)胞含量降至104個(gè),最大限度地降低了輸血不良反應(yīng)的發(fā)生,大大提高了血漿輸注的安全性E5]。本試驗(yàn)中新鮮血漿經(jīng)新型聯(lián)袋一次性使用去白細(xì)胞輸血濾器濾除,結(jié)果顯示經(jīng)MBP滅活血漿,每袋血漿約210~230ml,滅活后血漿中白細(xì)胞數(shù)量由(5.72±1.56)×106個(gè)/U下降到(1.14±0.37)×104個(gè)/U,白細(xì)胞去除率>99.80%,白細(xì)JChnTransfusLabMed,July,。2014,V°116,N°,。3胞數(shù)量降低2個(gè)數(shù)量級(jí),可有效預(yù)防非溶血性發(fā)熱反應(yīng)、HLA同種免疫及親白細(xì)胞病毒的傳播[6],。血漿是可發(fā)生經(jīng)輸血傳播疾病的主要血液成分之一,近年的用量持續(xù)增加,因此在保證血漿臨床輸用安全的同時(shí),提高血漿質(zhì)量和應(yīng)用效果是非常重要的,。本研究表明,經(jīng)過亞甲藍(lán)光化學(xué)技術(shù)滅活病毒的血漿,對(duì)血漿成分的影響較小,滅活后的血漿符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),可以滿足臨床安全輸血的需求,對(duì)提高輸血安全水平有一定的作用。
材料與方法
1 標(biāo)本來源均來源于淮北市中心血站⒛13年6月無償獻(xiàn)血血液標(biāo)本,隨機(jī)抽取應(yīng)用去白細(xì)胞四聯(lián)袋采集的30份400ml全血,利用采血后6h內(nèi)的制各新鮮血漿,在百級(jí)凈化間內(nèi)無菌連接血漿袋和病毒滅活過濾器,使血漿緩慢通過MB添加元件,血漿中亞甲藍(lán)終濃度為1um,。l/L,將含有亞甲藍(lán)的血漿流入病毒滅活耗材的一個(gè)空袋中,混勻后留樣10ml備檢,。然后將加人亞甲藍(lán)的血漿置4C病毒滅活箱的擱架上,擺動(dòng)頻率60次/mlll,利用30000~35000LX光照強(qiáng)度的可見光照射30min,將光照后的血漿通過病毒滅活過濾器濾除殘余的亞甲藍(lán)和白細(xì)胞,混勻后留樣10ml備檢。
2 主要儀器與試劑四聯(lián)采血袋(山東威高醫(yī)用品股份有限公司,批號(hào)1304282),含有MB添加元件的病毒滅活柜配套一次性病毒滅活血袋(上海輸血技術(shù)有限公司,批號(hào)130307),凝血因子Ⅱ、V,、Ⅶ,、Ⅷ、Ⅸ,、X,、Ⅺ、Ⅻ活性和纖維蛋白原(Fg)含量的測(cè)定試劑盒(SIEMENS,批號(hào)546553A),總蛋白(TP)試劑盒(上?？菩郎锛夹g(shù)研究所,批號(hào)20130405),6000I離心機(jī)(德國(guó)賀利氏),DXZⅡ型低溫操作臺(tái)(鄭州飛龍醫(yī)療設(shè)各有限公司),CA50全自動(dòng)血凝儀(日本Sysmex公司),HDME1A型醫(yī)用血漿病毒滅活柜(上海輸血技術(shù)有限公司),。
3 凝血因子和總蛋白含量的檢測(cè)凝血因子Ⅱ、V,、Ⅶ,、Ⅷ、Ⅸ,、X,、Ⅺ、Ⅻ的活性及Fg含量測(cè)定采用血凝儀,TP含量測(cè)定采用雙縮脲法,嚴(yán)格依據(jù)檢測(cè)試劑說明書操作,。
4 白細(xì)胞計(jì)數(shù)采用Nageotte血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)·291·數(shù),。白細(xì)胞濾除率=(濾除前血漿白細(xì)胞數(shù)-濾除后血漿白細(xì)胞數(shù))/濾除前血漿白細(xì)胞數(shù)×100%。
5 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Ⅰ±s)表示,處理前后各指標(biāo)的比較采用配對(duì)矽檢驗(yàn),。
結(jié)果
1 對(duì)血漿中凝血因子的影響經(jīng)亞甲藍(lán)光化學(xué)法處理30min后,血漿中凝血因子活性在處理后均有不同程度的損傷,多數(shù)在80%以上,。血漿凝血因子V和Ⅷ活性減少明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他凝血因子活性減少不明顯(P<0.05),
2 對(duì)血漿Fg和TP含量的影響血漿中Fg含量【g/L)下降了8.02%,TP含量(g/I')僅下降了3.91%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),
3 白細(xì)胞濾除效果白細(xì)胞濾除前新鮮血漿含有白細(xì)胞數(shù)為(5.72±1.56)×106個(gè)/U,白細(xì)胞濾過和亞甲藍(lán)光照處理后新鮮血漿白細(xì)胞殘留量(1.14±0.37)×104個(gè)/U(″=30),白細(xì)胞去除率>99.80%。
討論
MBP是一種安全,、有效,適用于單袋血漿病毒滅活的方法:l,M⒊P在滅活病毒的同時(shí)可能對(duì)凝血因子和蛋白有一定的負(fù)面作用,造成血漿有效成分的損失[5],。本次研究表明,血漿病毒滅活前、后有效成分的含量發(fā)生改變,。M⒊P可使血漿中的凝血因子含量降低,對(duì)穩(wěn)定凝血因子及血漿蛋白影響不大,。血漿凝血因子FⅡ、FⅦ,、FⅨ,、FX、FⅪ和FⅪ的回收率分別為91.11%,、91.08%,、89.14%、92.63%,、90.79%和93.60%,血漿Fg和TP回收率分別為91.98%和96.39%,病毒滅活前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,。不穩(wěn)定的凝血因子FⅤ和FⅧ活性明顯降低,回收率分別為84.19%和82.56%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍在國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)(新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.7IU/ml;病毒滅活新鮮冰凍血漿Ⅷ含量≥0.5IU/ml)。其主要原因是FⅧ,、Fv屬不穩(wěn)定凝血因子,離體后受外界的溫度及離體時(shí)間的影響,外界溫度越高,離體時(shí)間越長(zhǎng),含量或活性下降越明顯,。另一方面,亞甲藍(lán)在可見光照射時(shí)產(chǎn)生的自由基(一類機(jī)制),或單線態(tài)氧(二類機(jī)制)氧化損傷病毒分子結(jié)構(gòu)使其核酸斷裂,、復(fù)制終止的同時(shí),也對(duì)血漿一些蛋白成分造成損傷[6]。文獻(xiàn)[7’引認(rèn)為光照強(qiáng)度30000Lux,、光照時(shí)間30min,溫度(4±2)C的MBP處理?xiàng)l件既可有效滅活病毒又對(duì)凝血因子活性改變影響最小,該條件對(duì)外源性凝血系統(tǒng)影響不大,但對(duì)內(nèi)源性凝血系統(tǒng)(主要是FⅧ)有一定影響,。馬改娣等[9□也證實(shí)經(jīng)亞甲藍(lán)滅活后血漿FⅧ:C和Fv:C比滅活前活性均明顯降低,與本次研究結(jié)果基本相同。實(shí)驗(yàn)所用的MBP血漿病毒滅活方法不僅破壞了病毒穿透,、復(fù)制及感染能力,抑制了病毒的傳播,同時(shí)還濾除了血漿中殘留的白細(xì)胞,。血制品中殘留白細(xì)胞含量與輸血安全性密切相關(guān)。白細(xì)胞內(nèi)不僅含有潛在的致病因子,同時(shí)還與非溶血性發(fā)熱反應(yīng),、HI冫A同種免疫,、血小板輸注無效等疾病相關(guān)。研究表明:一般每單位血漿中殘余白細(xì)胞的數(shù)量約為105~107,濃度雖不高,但仍可導(dǎo)致與白細(xì)胞相關(guān)的輸血不良反應(yīng),更重要的是可攜帶如巨細(xì)胞病毒(CMV),、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型(HTLVI),、皰疹病毒(HTV)等輸血相關(guān)病毒[lO]。由于白細(xì)胞在血制品保存過程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)無法用白細(xì)胞濾器濾除,所以保存前給予濾除,既可以減少由白細(xì)胞數(shù)量和相關(guān)代謝產(chǎn)物所導(dǎo)致的不良輸血反應(yīng),也可避免由親白細(xì)胞病毒,、微生物等傳染性病原體導(dǎo)致的血源性感染,。因此各國(guó)對(duì)血制品中殘留白細(xì)胞的含量均有嚴(yán)格的限定,。歐洲現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是每個(gè)血制品包裝中應(yīng)少于1×106個(gè)白細(xì)胞,。M⒊P法中的白細(xì)胞濾除屬于儲(chǔ)存前過濾,因?yàn)樵?~72h內(nèi)過濾血液,白細(xì)胞沒有破碎,也未釋放出細(xì)胞因子,經(jīng)MBP滅活的血漿白細(xì)胞含量降至104個(gè),最大限度地降低了輸血不良反應(yīng)的發(fā)生,大大提高了血漿輸注的安全性E5]。本試驗(yàn)中新鮮血漿經(jīng)新型聯(lián)袋一次性使用去白細(xì)胞輸血濾器濾除,結(jié)果顯示經(jīng)MBP滅活血漿,每袋血漿約210~230ml,滅活后血漿中白細(xì)胞數(shù)量由(5.72±1.56)×106個(gè)/U下降到(1.14±0.37)×104個(gè)/U,白細(xì)胞去除率>99.80%,白細(xì)JChnTransfusLabMed,July,。2014,V°116,N°,。3胞數(shù)量降低2個(gè)數(shù)量級(jí),可有效預(yù)防非溶血性發(fā)熱反應(yīng)、HLA同種免疫及親白細(xì)胞病毒的傳播[6],。血漿是可發(fā)生經(jīng)輸血傳播疾病的主要血液成分之一,近年的用量持續(xù)增加,因此在保證血漿臨床輸用安全的同時(shí),提高血漿質(zhì)量和應(yīng)用效果是非常重要的,。本研究表明,經(jīng)過亞甲藍(lán)光化學(xué)技術(shù)滅活病毒的血漿,對(duì)血漿成分的影響較小,滅活后的血漿符合國(guó)家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),可以滿足臨床安全輸血的需求,對(duì)提高輸血安全水平有一定的作用。
