骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
早在19世紀(jì)中葉,就有人發(fā)現(xiàn)骨髓具有成骨能力,。40多年前,Friedenstein等觀察到骨髓細(xì)胞可在體外培養(yǎng)并貼壁生長(zhǎng)。在適宜的誘導(dǎo)條件下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)能分化為造血細(xì)胞以外的細(xì)胞,特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞,這種跨系分化,甚至跨胚層分化的特性被稱為“可塑性”,。同時(shí),骨髓MSC具有造血支持、免疫調(diào)節(jié)、多向分化等潛能,易于轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源基因,是細(xì)胞治療和基因治療的理想載體和靶細(xì)胞。
血管損傷,、缺血性疾病以及動(dòng)脈瘤等,都需要合適的血管移植物,臨床上應(yīng)用的血管移植物包括自體血管、異體血管和人工合成材料血管等,但由于種種原因,這些血管移植物已很少被使用或不適于替代小口徑血管,。
因此,隨著干細(xì)胞研究的重大進(jìn)展以及材料和塑形科學(xué)研究的不斷深入,利用組織工程學(xué)的方法構(gòu)建良好血管替代物的血管組織工程學(xué)就成為了研究熱點(diǎn),。
組織工程血管及相關(guān)研究
組織工程血管是利用各種血管壁細(xì)胞和相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì),制備并重建的三維血管組織,。目前,關(guān)于組織工程血管的研究主要包括種子細(xì)胞,、細(xì)胞支架、細(xì)胞支架和種子細(xì)胞復(fù)合體的培養(yǎng),、組織工程血管的抗凝特性和植入情況等,種子細(xì)胞的獲取,、培養(yǎng)和種植是組織工程血管研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在被用作組織工程血管的種子細(xì)胞多是自體血管壁細(xì)胞以及可定向分化的干細(xì)胞,由于骨髓MSC具有取材方便,、在體外可大量增殖,、無免疫原性等特點(diǎn),有望成為組織工程血管種子細(xì)胞的主要來源。
1. 種子細(xì)胞培養(yǎng)及生長(zhǎng)特點(diǎn)
利用密度梯度離心和貼壁的方法,獲取并純化骨髓MSC,原代培養(yǎng)可獲得約2×105個(gè)細(xì)胞,傳至第5代(P5)可獲得約4×108個(gè)細(xì)胞,擴(kuò)增10代,細(xì)胞數(shù)約為8×1010,可基本滿足組織工程需要,。通過對(duì)P0,、P5、P10 3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),傳代培養(yǎng)的潛伏期為24~48小時(shí),傳代培養(yǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期為4~6 天,。接種后8~9天進(jìn)入平臺(tái)期,細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)逐漸緩慢,。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原顯示,細(xì)胞高表達(dá)CD105,弱表達(dá)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR,不表達(dá)HLA-DR、CD34,、CD45,、CD11a及CD14。
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P2~P4細(xì)胞,用含全反式維甲酸,、二丁酰環(huán)磷酸腺苷鈣的DMEM低糖培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化,2周后細(xì)胞融合成片,可見細(xì)胞伸出較長(zhǎng)突起相互接觸,平行排列,并向同一方向生長(zhǎng),形成峰谷樣外觀,。誘導(dǎo)14天后,β肌動(dòng)蛋白陽性,符合血管平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)。誘導(dǎo)2周后,掃描電鏡顯示,細(xì)胞呈帶狀,平行排列,細(xì)胞周邊伸出許多絲狀突起,與相鄰細(xì)胞的突起交織成網(wǎng),。透射電鏡可見,胞漿內(nèi)肌絲形成,多分布于核周及胞體突起內(nèi),細(xì)胞核呈鋸齒狀,。胞漿內(nèi)細(xì)胞器多時(shí)肌絲較少,位于胞膜附近,。細(xì)胞內(nèi)常見較多發(fā)育好的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和較大線粒體,表現(xiàn)為較原始或發(fā)育初期血管內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)。
取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P4~P6細(xì)胞,用含血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液誘導(dǎo),2周后,細(xì)胞呈鵝卵石樣,。誘導(dǎo)14天后,細(xì)胞表達(dá)血管性假血友病因子(vWF),。掃描電鏡顯示,細(xì)胞呈橢圓形、多角形或長(zhǎng)方形等,平行排列,細(xì)胞表面也有絨毛樣突起與周圍細(xì)胞相互交織,但突起較少,。透射電鏡可見誘導(dǎo)的細(xì)胞表面有豐富的指狀,、球狀或絨毛狀突起,核一般呈卵圓形或腎型,位于中央,染色質(zhì)致密,核周胞質(zhì)及胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體,、游離核糖體,、高爾基復(fù)合體和溶酶體等,還可見大量吞飲小泡,主要分布于胞膜內(nèi)面,有些小泡有長(zhǎng)頸與胞膜相連,有些彼此匯合成管狀,一端或兩端與細(xì)胞膜相連,具有內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)。
2.細(xì)胞支架制備
鼠尾尾腱經(jīng)乙酸溶液作用和鹽析等處理后,獲取膠原蛋白,再用戊二醛交聯(lián),。將膠原包埋的聚乙醇酸(PGA)放入序列凍干機(jī)中,真空冷凍干燥24小時(shí),即可得到片狀的膠原蛋白包埋PGA支架,該復(fù)合支架質(zhì)地均勻,柔韌,固定成型,吸水性良好,。細(xì)胞在膠原包埋的PGA支架上生長(zhǎng)良好,該復(fù)合支架與誘導(dǎo)的血管平滑肌樣細(xì)胞的組織相容性也很好。
3. 組織工程血管的制備
將2 cm×3 cm的復(fù)合支架平鋪于6孔板內(nèi),。標(biāo)記種子細(xì)胞,收集P2~P3血管平滑肌樣細(xì)胞,分期種植于支架表面,使細(xì)胞數(shù)量達(dá)到4×106,。將無菌ECMgel均勻涂抹于支架表面,分期種植血管內(nèi)皮樣細(xì)胞,使細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1×106。
實(shí)驗(yàn)分組情況為,對(duì)照組:將外徑為4 mm的玻璃棒置入狗的皮下;單純支架組:將未接種細(xì)胞的支架植入狗的皮下;實(shí)驗(yàn)組:將上述種植有種子細(xì)胞的復(fù)合支架包裹在直徑4 mm的玻璃棒周圍,植于狗的皮下(為種子細(xì)胞供體動(dòng)物),。
結(jié)果顯示,8周后,對(duì)照組的玻璃棒周圍纖維組織稍增厚,抽去玻璃棒,不能維持管型結(jié)構(gòu),。單純支架組的管型結(jié)構(gòu)稍明顯,但管壁仍較薄。實(shí)驗(yàn)組的玻璃棒周圍管型結(jié)構(gòu)明顯,呈血管樣改變,。組織學(xué)觀察顯示,對(duì)照組主要為纖維組織,細(xì)胞成分少,。單純支架組的管壁中細(xì)胞數(shù)量較少,分布較均勻,管壁結(jié)構(gòu)不清晰,周圍膠原成分增多。實(shí)驗(yàn)組的管壁結(jié)構(gòu)較清晰,細(xì)胞數(shù)量也較少,膠原成分增多,管壁明顯可見內(nèi)膜,、中膜和外膜,。單純支架組可承受100~150 mm Hg的血管腔內(nèi)壓力,實(shí)驗(yàn)組可承受200 mm Hg的血管腔內(nèi)壓力而不破裂。免疫熒光檢測(cè)顯示,部分細(xì)胞來源于所種植的種子細(xì)胞,。
4. 組織工程血管移植實(shí)驗(yàn)
用所構(gòu)建的組織工程血管進(jìn)行血管移植實(shí)驗(yàn),。實(shí)驗(yàn)組移植物為所構(gòu)建的組織工程化血管,對(duì)照組移植物為單純支架組所形成的管狀物。移植部位為狗股動(dòng)脈,。
結(jié)果顯示,移植后組織工程血管通暢,近端和遠(yuǎn)端股動(dòng)脈搏動(dòng)良好,吻合口無滲漏,管壁無瘤樣擴(kuò)張,肢體無缺血改變,。移植后1周,在體時(shí)血管通暢,搏動(dòng)良好,管壁無瘤樣擴(kuò)張,肢體無缺血改變。切除移植血管可見,實(shí)驗(yàn)組組織工程血管長(zhǎng)約3 cm,管壁略厚,管腔通暢,內(nèi)膜粗糙,但無血栓形成,。對(duì)照組血管內(nèi)已有血栓形成,管腔閉塞,。
移植后2周,實(shí)驗(yàn)組在體血管通暢,搏動(dòng)良好,管壁仍無瘤樣擴(kuò)張,肢體無缺血改變。切除后可見,血管長(zhǎng)約3 cm,管壁進(jìn)一步發(fā)育成熟,管腔通暢,內(nèi)膜已明顯光滑,與正常血管壁相似,無血栓形成,。管壁HE染色與正常生理性血管壁結(jié)構(gòu)相似,。內(nèi)膜表面完整,有連續(xù)單層扁平上皮細(xì)胞覆蓋,中膜有平滑肌樣細(xì)胞,但細(xì)胞數(shù)量較少,膠原和細(xì)胞外基質(zhì)成分較多,膠原纖維排列整齊且致密。外膜主要為疏松結(jié)締組織。免疫熒光顯示,組織工程血管內(nèi)膜vWF陽性,中膜β肌動(dòng)蛋白陽性,。同時(shí)檢測(cè)所標(biāo)記的種子細(xì)胞證實(shí),管壁細(xì)胞主要來源于所種植的種子細(xì)胞,。
總 結(jié)
上述研究證實(shí):①骨髓MSC表達(dá)CD105和KDR,具有分化為血管壁細(xì)胞的潛能;②骨髓MSC能在體外定向分化為具有平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞特性的細(xì)胞,可作為血管壁細(xì)胞的種子細(xì)胞;③種子細(xì)胞在膠原包埋的PGA復(fù)合支架上生長(zhǎng)好,兩者具有良好的組織相容性;④動(dòng)物皮下可以作為生物反應(yīng)器,構(gòu)建的組織工程血管的組織結(jié)構(gòu)和生理血管的組織結(jié)構(gòu)相似;⑤該組織工程血管可以作為血管的替代物用于血管移植,種子細(xì)胞參與了血管結(jié)構(gòu)的重構(gòu)。
