繼2008年8月在《自然》雜志上發(fā)表禽流感病毒RNA論文之后,，中國科學(xué)院生物物理研究所研究員劉迎芳領(lǐng)導(dǎo)的課題組和饒子和院士領(lǐng)導(dǎo)的南開大學(xué)、清華大學(xué)和生物物理所聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,，在前期工作的基礎(chǔ)上,，進(jìn)一步解析了該RNA聚合酶PA亞基剩余的氨基端（PAN）的高分辨率晶體結(jié)構(gòu),，從而基本完成了對流感病毒聚合酶PA亞基的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究工作。他們的研究結(jié)果清晰地揭示了PA蛋白具有核酸內(nèi)切酶功能,。這一結(jié)果推翻了以往報(bào)道的PB1亞基在聚合酶復(fù)合體中行使此項(xiàng)功能的推論,。2月4日，《自然》再次在線發(fā)表了他們的最新合作研究成果,，并專門配發(fā)了新聞,，介紹了這一重要研究成果。
據(jù)介紹,，禽感病毒是含有8個(gè)RNA基因組片段的負(fù)鏈RNA病毒,，已知可以編碼11種病毒蛋白質(zhì)。其中,，PB1,、PB2和PA等3個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成流感病毒重要的生命機(jī)器：流感病毒RNA聚合酶。在禽流感病毒的復(fù)制和感染的過程中,，流感病毒聚合酶發(fā)揮了至關(guān)重要的作用,，它負(fù)責(zé)行使病毒基因組RNA的復(fù)制以及病毒mRNA轉(zhuǎn)錄等多方面功能。其中,，PB2蛋白負(fù)責(zé)捕捉宿主細(xì)胞的mRNA分子用于自身mRNA轉(zhuǎn)錄,，PB1含有聚合酶活性中心,，是行使病毒NA的合成功能的催化亞基，而PA在該復(fù)合體的功能一直沒有明確,。研究流感病毒聚合酶的結(jié)構(gòu),，不僅僅對揭示流感病毒聚合酶的作用機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，還將對臨床上抗病毒藥物的研發(fā)提供清晰的分子模型,。但是,，由于在研究這一復(fù)合體中存在種種困難，這一復(fù)合體或者其組成的亞基的結(jié)構(gòu)一直沒有被揭示,。
劉迎芳和饒子和抓住這一問題不放,，終于逐步系統(tǒng)地解析了H5N1毒株RNA聚合酶復(fù)合體PA亞基的基本結(jié)構(gòu)。通過對該結(jié)構(gòu)的分析,，他們推測,，該蛋白有可能是一個(gè)具有新型結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。據(jù)此,，他們進(jìn)一步開展了一系列的體內(nèi)和體外的分子生物學(xué),、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)分析，其結(jié)果充分證實(shí)了他們根據(jù)結(jié)構(gòu)分析所作出的推測是正確的,。該內(nèi)切核酸酶活性將使聚合酶復(fù)合體捕獲的宿主細(xì)胞mRNA,，被流感病毒聚合酶內(nèi)切酶切割，以用于病毒mRNA轉(zhuǎn)錄,。這一活性的缺失,，將造成病毒不能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA。這一結(jié)論首次清晰地揭示了PA參與病毒轉(zhuǎn)錄功能的一個(gè)重要分子機(jī)制,，同時(shí)還首次證明了禽流感病毒RNA聚合酶中所具有的核酸內(nèi)切酶功能是在PA亞基上,，而不是在以往人們報(bào)道的PB1亞基上。這一研究結(jié)果不僅揭示了PA的功能機(jī)制,，而且還為相關(guān)藥物研發(fā)提供了一個(gè)新的原子水平的精細(xì)結(jié)構(gòu)平臺,。
據(jù)中科院生命科學(xué)與生物技術(shù)局相關(guān)人士介紹，目前,，除了國內(nèi)禽流感疫情外,，由于禽鳥遷徙等原因，我國周邊國家的禽流感疫情也不容忽視,。印尼是目前世界上禽流感疫情最嚴(yán)重的國家,，截至2008年底，該國共發(fā)生人感染禽流感病例139例,，其中113人死亡,；越南僅次于印尼，截至2008年底,，共有107個(gè)病例,，其中52人死亡。此外,，印度,、孟加拉、越南也陸續(xù)暴發(fā)疫情,。盡管由于各國加強(qiáng)監(jiān)督及加速撲殺可能染病的家禽,，在亞洲，至今已有高達(dá)5億只家禽死于禽流感或?yàn)榭刂埔咔槎粨錃?，H5N1致命病例過去兩年連續(xù)減少,，家禽暴發(fā)疫情的國家近年也減少了，但是禽流感的威脅始終揮之不去,。自2003年暴發(fā)疫情后,，H5N1一直保持在“最低程度的散發(fā)，多次卻驟然爆發(fā)”狀態(tài),。
PAN結(jié)構(gòu)
劉迎芳說,，在此項(xiàng)最新研究工作中，英國牛津大學(xué)的Ervin Fodor博士及Tao Deng博士,、新加坡國立大學(xué)Ruowen Ge博士等亦參與了部分研究工作,，美國APS同步輻射中心教授張榮光在數(shù)據(jù)收集中也提供了幫助。此外,，中國農(nóng)科院陳化蘭,、于康鎮(zhèn)教授提供了病毒基因。
該研究課題得到了國家自然科學(xué)基金委,、科技部和中國科學(xué)院的扶持和資助,。（生物谷Bioon.com）
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Nature advance online publication 4 February 2009 | doi:10.1038/nature07720
Crystal structure of an avian influenza polymerase PAN reveals an endonuclease active site
Puwei Yuan1,6, Mark Bartlam2,6, Zhiyong Lou3,6, Shoudeng Chen1, Jie Zhou1, Xiaojing He1, Zongyang Lv1, Ruowen Ge4, Xuemei Li1,3, Tao Deng2,5, Ervin Fodor5, Zihe Rao1,2,3 & Yingfang Liu1
1 National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2 College of Life Sciences and Tianjin Key Laboratory of Protein Science, Nankai University, Tianjin 300071, China
3 Laboratory of Structural Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China
4 Department of Biological Sciences, National University of Singapore, Singapore 117543
5 Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, Oxford OX1 3RE, UK
6 These authors contributed equally to this work.
The heterotrimeric influenza virus polymerase, containing the PA, PB1 and PB2 proteins, catalyses viral RNA replication and transcription in the nucleus of infected cells. PB1 holds the polymerase active site1 and reportedly harbours endonuclease activity2, whereas PB2 is responsible for cap binding2, 3, 4. The PA amino terminus is understood to be the major functional part of the PA protein and has been implicated in several roles, including endonuclease5 and protease activities6 as well as viral RNA/complementary RNA promoter binding7. Here we report the 2.2 ?ngstr?m (?) crystal structure of the N-terminal 197 residues of PA, termed PAN, from an avian influenza H5N1 virus. The PAN structure has an / architecture and reveals a bound magnesium ion coordinated by a motif similar to the (P)DXN(D/E)XK motif characteristic of many endonucleases. Structural comparisons and mutagenesis analysis of the motif identified in PAN provide further evidence that PAN holds an endonuclease active site. Furthermore, functional analysis with in vivo ribonucleoprotein reconstitution and direct in vitro endonuclease assays strongly suggest that PAN holds the endonuclease active site and has critical roles in endonuclease activity of the influenza virus polymerase, rather than PB1. The high conservation of this endonuclease active site among influenza strains indicates that PAN is an important target for the design of new anti-influenza therapeutics.
