岳桂平 譯

華中農(nóng)業(yè)大學 生命科學院

人類基因組計劃所提供的大量數(shù)據(jù)，加速人類一些常見疾病機理的研究,，幫助人們發(fā)現(xiàn)更多用于藥物治療靶蛋白,。與此同時,，具有抗靶蛋白活性的復合體的數(shù)量和多樣性的也在逐步的擴展。生物和化學交叉結合的趨勢推動在早期藥物研發(fā)中應用,，可靠快速的,，選擇性強，高通量篩選分析法,。這種分析方法的典型特點就是可以自動掃描大量化合物,，篩選針對一種既定的靶子或激活或抑制性的化合物。這種分析方法可以歸為兩類：無細胞篩選法（生物化學方法）和基于細胞篩選法（細胞學方法）,。

在應用重組DNA和生物技術之前,，藥物研發(fā)通常是在不知道潛在靶分子的情況下，利用整個組織或細胞來篩選生物活性物質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)和基因鑒定技術的發(fā)展,，以及對常見的人類疾病的分子機制認識的加深，一種以發(fā)生機制為基礎篩選方法,，也就是藥物研發(fā)中用到的基于靶物質(zhì)的藥物研發(fā)方法,，已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的非特異性的化驗方法。為了能夠快速的分析不計其數(shù)的化合物對于他們特異性靶子的功能和作用效應,，就發(fā)展了所謂的高通量掃描法（High-throughput screenings ,，HTS）。
高通量掃描法通常被認為是一種很機械的方法,，因此,，應有的實驗方法一般不要進行太多處理，樣品被排列在小的容器中,，例如在96孔板上,，96孔板提供了一個可以自動鑒定的標準平臺。許多非細胞依賴性的鑒定方法起初多數(shù)是用來鑒定純化蛋白質(zhì)的生化活性,，這些蛋白質(zhì)大多是酶類,；而現(xiàn)在高通量掃描方法不需要將反應產(chǎn)物與底物分離就可以進行檢測，很自然取代了傳統(tǒng)方法,。例如,，熒光技術在無需分離或者純化程序的情況下可以鑒定分子之間的反應，也可以鑒定酶活性,。這些自動化鑒定方法保證了快速地掃描大型化合物庫,，可以鑒定出在體外對特異靶有生物活性的化合物（稱為hits）。這些化合物經(jīng)過化學修飾,，再通過高通量篩選方法選擇更特異有效的衍生物,，稱為先導化合物（lead compounds）。在傳統(tǒng)藥物研發(fā)過程中,，應有細胞或者動物模型對這些這些先導化合物進行實驗,，以選擇用于臨床試驗的藥物。

近幾年來,，利用工程改造的細胞和微生物進行篩選的方法,，也就是基于細胞篩選方法成為替代傳統(tǒng)體外生物化學高通量鑒定方法中最具有吸引力的一個方法。這種體外檢測方法需要弄清楚特定的靶分子所引發(fā)的特定細胞行為過程,，而且還需要建立一種易于檢測產(chǎn)物量的方法,。越來越多的可以對細胞進行遺傳改造的生物技術的建立使這種方法更容易了。
基于細胞篩選方法與體外篩選方法相比有很多顯著的優(yōu)點,。第一,，不需要純化靶蛋白，因此就不必為獲得一個具有生物活性靶子進行投資。隨著可以用于治療的藥物靶子增多,，這種優(yōu)勢越來越明顯,。因為，在自然底物未知的情況下很難建立一個針對成千上萬的這些新蛋白的生化鑒定方法,。第二,，在細胞中靶蛋白的構象，活性以及生物學功能更接近于自然生理狀態(tài),。第三,，基于細胞篩選方法能夠很快鑒定出拮抗性的化合物，這種化合物一般都是有細胞毒性的,，或者是不能夠跨過細胞膜達到細胞內(nèi)靶子的化合物,。因此，經(jīng)過篩選得到的hits和先導化合物具有更高的可靠性,。在藥物研發(fā)過程中,，這種方法可以節(jié)省時間和費用。
理想情況下利用人來源的細胞是最好的,，因為人來源細胞提供最接近生理狀態(tài)的模型系統(tǒng),。但是，在檢測輸出量的過程中其他多余加工產(chǎn)生的效應都很難控制,，而且這些效應很難和所期望的針對特定靶特異性的效應區(qū)分開來,。經(jīng)過遺傳修飾的哺乳細胞一般是值得懷疑的，又耗費時間,。而且,，培養(yǎng)人細胞一般費用都很貴，而且有時候在高通量篩選的自動化系統(tǒng)中很難繁殖,。

　　微生物如酵母為在不同的細胞背景下（尤其是真核細胞）鑒定給定的人蛋白質(zhì),，提供一種很簡便的方法。在酵母中,，人類蛋白能夠組成性的表達,。而且，可以營造一個好多方面都和人類生理條件很相似的環(huán)境,，因為在人類細胞和酵母之間,，一些基本的分子和細胞機制存在著高度的保守性。許多人類蛋白在酵母中具有功能,，這表明在這種真核生物中,，蛋白質(zhì)具有所需的結構和穩(wěn)定性，以及蛋白與蛋白質(zhì)相互作用等等,。盡管在人類細胞和酵母之間一些基礎的細胞過程有高度的相似性,，酵母和人類細胞還是有差異，不能得到完全相同的人靶蛋白，也會降低鑒定一些潛在的藥物的可能性,。因此,，酵母也不是適用所有的人類靶蛋白。盡管這樣,，即使考慮到這些因素,，人們?nèi)匀还J把酵母用于高通量篩選的細胞檢測方法有許多不可替代的優(yōu)點。
　　　酵母優(yōu)于哺乳動物細胞的一個主要的方面就是多樣的遺傳柔韌性,，也正是這一特點使酵母在過去３０年里成為了分子和細胞生物學研究優(yōu)先選擇的對象。酵母的這種特性以及酵母在遺傳學和分子生物學方面多年的經(jīng)驗使得用酵母發(fā)展多種基因工具和細胞選擇系統(tǒng)成為可能,，而且也就很容易被轉(zhuǎn)化用于高通量篩選,。這些分子和細胞工具包括，高級的質(zhì)粒系統(tǒng),，同源重組技術,，以及選擇易于篩選的標記。有營養(yǎng)型篩選如URA3, HIS3, LEU2和其它基因,，有藥物抗性(如kanr, natr)和藥物敏感性(cyhr, GAL1, URA3)篩選以及比色篩選（如LacZ, GFP, Luciferase）等等,。這種真核微生物用于高通量細胞篩選還有另外的一個優(yōu)點就是培養(yǎng)和處理酵母的花費很低。而且,，哺乳動物細胞多余的加工過程往往不能鑒定對靶分子一些特異效應,，而酵母同源重組系統(tǒng)可以在一個嘈雜的背景中檢測人蛋白質(zhì)表達。盡管酵母有一個細胞壁包著而且它們的漿膜在某種程度上和哺乳動物細胞對應的部分也不完全相同,，任何能夠滲透進入酵母細胞的成分都可以進入人類細胞,。很顯然，細胞壁本身不能夠限制小分子的滲透性,，化合物的流出可能是降低細胞內(nèi)化合物濃度的一個重要的機制而不是細胞膜的滲透性,。在酵母中，很容易控制這個過程,，而且可以通缺失過主要的ＡＢＣ轉(zhuǎn)運因子降低這種效應,。

　　　因此，在一個同源重組的真核生物體中和在遺傳功能多樣性的酵母的細胞環(huán)境中再現(xiàn)人類蛋白質(zhì)的功能的可能性促使研究者利用工程化的酵母細胞建立一種靶特異性的高通量鑒定方法,。
　　　雖然非依賴細胞篩選方法有許多優(yōu)點,，但是細胞篩選方法提供了一個細胞環(huán)境，這種環(huán)境可以使的靶分子處于天然生理狀態(tài),，而且化合物之間的相互作用也更加的精確,。酵母易進行遺傳操作和高度保守的基本分子機制，這些特性使這種真核微生物在靶特異性藥物篩選中具有重要的價值,。事實上,，決定那種篩選方法最適合于高通量篩選特異性靶，依賴于靶分子的生物學和生物化學特性。