岳桂平 譯

華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院

人類基因組計(jì)劃所提供的大量數(shù)據(jù),，加速人類一些常見疾病機(jī)理的研究,，幫助人們發(fā)現(xiàn)更多用于藥物治療靶蛋白。與此同時(shí),，具有抗靶蛋白活性的復(fù)合體的數(shù)量和多樣性的也在逐步的擴(kuò)展,。生物和化學(xué)交叉結(jié)合的趨勢(shì)推動(dòng)在早期藥物研發(fā)中應(yīng)用，可靠快速的,，選擇性強(qiáng),，高通量篩選分析法。這種分析方法的典型特點(diǎn)就是可以自動(dòng)掃描大量化合物,，篩選針對(duì)一種既定的靶子或激活或抑制性的化合物,。這種分析方法可以歸為兩類：無細(xì)胞篩選法（生物化學(xué)方法）和基于細(xì)胞篩選法（細(xì)胞學(xué)方法）。

在應(yīng)用重組DNA和生物技術(shù)之前,，藥物研發(fā)通常是在不知道潛在靶分子的情況下,，利用整個(gè)組織或細(xì)胞來篩選生物活性物質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)和基因鑒定技術(shù)的發(fā)展,，以及對(duì)常見的人類疾病的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的加深,，一種以發(fā)生機(jī)制為基礎(chǔ)篩選方法，也就是藥物研發(fā)中用到的基于靶物質(zhì)的藥物研發(fā)方法,，已經(jīng)取代了傳統(tǒng)的非特異性的化驗(yàn)方法,。為了能夠快速的分析不計(jì)其數(shù)的化合物對(duì)于他們特異性靶子的功能和作用效應(yīng)，就發(fā)展了所謂的高通量掃描法（High-throughput screenings ,，HTS）,。
高通量掃描法通常被認(rèn)為是一種很機(jī)械的方法，因此,，應(yīng)有的實(shí)驗(yàn)方法一般不要進(jìn)行太多處理,，樣品被排列在小的容器中，例如在96孔板上,，96孔板提供了一個(gè)可以自動(dòng)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)平臺(tái),。許多非細(xì)胞依賴性的鑒定方法起初多數(shù)是用來鑒定純化蛋白質(zhì)的生化活性，這些蛋白質(zhì)大多是酶類,；而現(xiàn)在高通量掃描方法不需要將反應(yīng)產(chǎn)物與底物分離就可以進(jìn)行檢測(cè),，很自然取代了傳統(tǒng)方法。例如,，熒光技術(shù)在無需分離或者純化程序的情況下可以鑒定分子之間的反應(yīng),，也可以鑒定酶活性,。這些自動(dòng)化鑒定方法保證了快速地掃描大型化合物庫，可以鑒定出在體外對(duì)特異靶有生物活性的化合物（稱為hits）,。這些化合物經(jīng)過化學(xué)修飾,，再通過高通量篩選方法選擇更特異有效的衍生物，稱為先導(dǎo)化合物（lead compounds）,。在傳統(tǒng)藥物研發(fā)過程中,，應(yīng)有細(xì)胞或者動(dòng)物模型對(duì)這些這些先導(dǎo)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以選擇用于臨床試驗(yàn)的藥物,。

近幾年來,，利用工程改造的細(xì)胞和微生物進(jìn)行篩選的方法，也就是基于細(xì)胞篩選方法成為替代傳統(tǒng)體外生物化學(xué)高通量鑒定方法中最具有吸引力的一個(gè)方法,。這種體外檢測(cè)方法需要弄清楚特定的靶分子所引發(fā)的特定細(xì)胞行為過程,，而且還需要建立一種易于檢測(cè)產(chǎn)物量的方法。越來越多的可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造的生物技術(shù)的建立使這種方法更容易了,。
基于細(xì)胞篩選方法與體外篩選方法相比有很多顯著的優(yōu)點(diǎn),。第一，不需要純化靶蛋白,，因此就不必為獲得一個(gè)具有生物活性靶子進(jìn)行投資,。隨著可以用于治療的藥物靶子增多，這種優(yōu)勢(shì)越來越明顯,。因?yàn)?，在自然底物未知的情況下很難建立一個(gè)針對(duì)成千上萬的這些新蛋白的生化鑒定方法。第二,，在細(xì)胞中靶蛋白的構(gòu)象,，活性以及生物學(xué)功能更接近于自然生理狀態(tài)。第三,，基于細(xì)胞篩選方法能夠很快鑒定出拮抗性的化合物,，這種化合物一般都是有細(xì)胞毒性的，或者是不能夠跨過細(xì)胞膜達(dá)到細(xì)胞內(nèi)靶子的化合物,。因此,，經(jīng)過篩選得到的hits和先導(dǎo)化合物具有更高的可靠性。在藥物研發(fā)過程中,，這種方法可以節(jié)省時(shí)間和費(fèi)用。
理想情況下利用人來源的細(xì)胞是最好的,，因?yàn)槿藖碓醇?xì)胞提供最接近生理狀態(tài)的模型系統(tǒng),。但是，在檢測(cè)輸出量的過程中其他多余加工產(chǎn)生的效應(yīng)都很難控制,，而且這些效應(yīng)很難和所期望的針對(duì)特定靶特異性的效應(yīng)區(qū)分開來,。經(jīng)過遺傳修飾的哺乳細(xì)胞一般是值得懷疑的,，又耗費(fèi)時(shí)間。而且,，培養(yǎng)人細(xì)胞一般費(fèi)用都很貴,，而且有時(shí)候在高通量篩選的自動(dòng)化系統(tǒng)中很難繁殖。

　　微生物如酵母為在不同的細(xì)胞背景下（尤其是真核細(xì)胞）鑒定給定的人蛋白質(zhì),，提供一種很簡(jiǎn)便的方法,。在酵母中，人類蛋白能夠組成性的表達(dá),。而且,，可以營造一個(gè)好多方面都和人類生理?xiàng)l件很相似的環(huán)境，因?yàn)樵谌祟惣?xì)胞和酵母之間,，一些基本的分子和細(xì)胞機(jī)制存在著高度的保守性,。許多人類蛋白在酵母中具有功能，這表明在這種真核生物中,，蛋白質(zhì)具有所需的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性,，以及蛋白與蛋白質(zhì)相互作用等等。盡管在人類細(xì)胞和酵母之間一些基礎(chǔ)的細(xì)胞過程有高度的相似性,，酵母和人類細(xì)胞還是有差異,，不能得到完全相同的人靶蛋白，也會(huì)降低鑒定一些潛在的藥物的可能性,。因此,，酵母也不是適用所有的人類靶蛋白。盡管這樣,，即使考慮到這些因素,，人們?nèi)匀还J(rèn)把酵母用于高通量篩選的細(xì)胞檢測(cè)方法有許多不可替代的優(yōu)點(diǎn)。
　　　酵母優(yōu)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一個(gè)主要的方面就是多樣的遺傳柔韌性,，也正是這一特點(diǎn)使酵母在過去３０年里成為了分子和細(xì)胞生物學(xué)研究?jī)?yōu)先選擇的對(duì)象,。酵母的這種特性以及酵母在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面多年的經(jīng)驗(yàn)使得用酵母發(fā)展多種基因工具和細(xì)胞選擇系統(tǒng)成為可能，而且也就很容易被轉(zhuǎn)化用于高通量篩選,。這些分子和細(xì)胞工具包括,，高級(jí)的質(zhì)粒系統(tǒng)，同源重組技術(shù),，以及選擇易于篩選的標(biāo)記,。有營養(yǎng)型篩選如URA3, HIS3, LEU2和其它基因，有藥物抗性(如kanr, natr)和藥物敏感性(cyhr, GAL1, URA3)篩選以及比色篩選（如LacZ, GFP, Luciferase）等等,。這種真核微生物用于高通量細(xì)胞篩選還有另外的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是培養(yǎng)和處理酵母的花費(fèi)很低,。而且，哺乳動(dòng)物細(xì)胞多余的加工過程往往不能鑒定對(duì)靶分子一些特異效應(yīng)，而酵母同源重組系統(tǒng)可以在一個(gè)嘈雜的背景中檢測(cè)人蛋白質(zhì)表達(dá),。盡管酵母有一個(gè)細(xì)胞壁包著而且它們的漿膜在某種程度上和哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)應(yīng)的部分也不完全相同,，任何能夠滲透進(jìn)入酵母細(xì)胞的成分都可以進(jìn)入人類細(xì)胞。很顯然,，細(xì)胞壁本身不能夠限制小分子的滲透性,，化合物的流出可能是降低細(xì)胞內(nèi)化合物濃度的一個(gè)重要的機(jī)制而不是細(xì)胞膜的滲透性。在酵母中,，很容易控制這個(gè)過程,，而且可以通缺失過主要的ＡＢＣ轉(zhuǎn)運(yùn)因子降低這種效應(yīng)。

　　　因此,，在一個(gè)同源重組的真核生物體中和在遺傳功能多樣性的酵母的細(xì)胞環(huán)境中再現(xiàn)人類蛋白質(zhì)的功能的可能性促使研究者利用工程化的酵母細(xì)胞建立一種靶特異性的高通量鑒定方法,。
　　　雖然非依賴細(xì)胞篩選方法有許多優(yōu)點(diǎn)，但是細(xì)胞篩選方法提供了一個(gè)細(xì)胞環(huán)境,，這種環(huán)境可以使的靶分子處于天然生理狀態(tài),，而且化合物之間的相互作用也更加的精確。酵母易進(jìn)行遺傳操作和高度保守的基本分子機(jī)制,，這些特性使這種真核微生物在靶特異性藥物篩選中具有重要的價(jià)值,。事實(shí)上，決定那種篩選方法最適合于高通量篩選特異性靶,，依賴于靶分子的生物學(xué)和生物化學(xué)特性,。