作物許多重要農(nóng)藝性狀,，如產(chǎn)量,、品質(zhì)、生育期等均屬于數(shù)量性狀,，對控制數(shù)量性狀的基因 (Quantitative trait loci,QTL) 開展研究已成為現(xiàn)代遺傳學(xué)的熱點(diǎn)之一,。QTL 的鑒定和克隆不僅有利于從分子水平上闡明這些性狀的發(fā)育和形成機(jī)理，而且對于有效開展數(shù)量性狀分子育種,，進(jìn)一步提高作物品種的產(chǎn)量,、品質(zhì)和抗性水平具有重要意義,。近年來，作物數(shù)量性狀基因克隆取得了重要突破,，一批控制復(fù)雜農(nóng)藝性狀的 QTL 已被成功分離。隨著植物基因組研究的日益廣泛和深入,，作物 QTL 的圖位克隆技術(shù)將有新的發(fā)展,。
1 數(shù)量性狀基因克隆基本思路
數(shù)量性狀由多基因控制，并受環(huán)境條件影響,，其表型變異是連續(xù)的,，一般只能通過統(tǒng)計分析方法來確定其遺傳座位。從本質(zhì)上看,，QTL 的定位研究只是以一定概率標(biāo)準(zhǔn)說明在基因組的某些區(qū)段可能存在影響某個數(shù)量性狀的 QTL,，至于這些 QTL 包含多少個基因，包含什么基因,，以及它們?nèi)绾巫饔糜谀繕?biāo)性狀,，則需通過遺傳學(xué)的方法進(jìn)一步去鑒定。
在遺傳上,，QTL 與控制質(zhì)量性狀的基因是一樣的,，都能夠通過遺傳重組進(jìn)行分離，差異只是在遺傳效應(yīng)大小方面,，而且同一座位既是一個 QTL,，也可能是一個主基因，這取決于所考察的等位基因,。因此,，QTL 克隆的基本思路與控制質(zhì)量性狀的主基因是相似的，即首先將初步定位的 QTL 界定到一個很小的基因組區(qū)域,，然后提名候選基因,，進(jìn)行序列分析，最后進(jìn)行功能驗證,。由于一個數(shù)量性狀的分離通常由多個 QTL 共同決定,，每一個的貢獻(xiàn)較小，且這些 QTL 常常緊密連鎖在一起,，因此 QTL克隆的關(guān)鍵問題是如何將控制所研究性狀的多個 QTL 分解為單個孟德爾因子,。近年來在水稻、玉米和番茄上進(jìn)行的 QTL 分離和克隆的開創(chuàng)性工作,，為解決這一問題提供了有效途徑和具體方法,。
2 作物數(shù)量性狀基因圖位克隆進(jìn)展
2.1 已被成功克隆的作物 QTL
目前已報道被成功克隆的作物 QTL 有9個(表1)。其中水稻上的 Hd1,、Hd6,、Hd3 和 Ehd1 都與抽穗期有關(guān),；玉米的 tb1 和 Dwarf8 分別控制株型和生育期；而番茄的 Brix9-2-5,、fw2.2 和 Ovate 則分別作用于糖含量,、果重和果形。從表1可以看出,，用于作物 QTL 克隆的方法有3種,，除 tb1 和 Dwarf8 分別通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法和候選基因法被克隆外，其他 QTL 的克隆均采用圖位法,，可見目前圖位克隆仍是作物 QTL 克隆的主要方法,。
2.2 作物 QTL 圖位克隆的基本原理和方法
圖位克隆方法的主要原理是根據(jù)基因在圖譜上的相對位置來克隆基因。目前利用該方法已經(jīng)在多種生物中克隆到大量的主基因,。在圖位克隆中,，QTL 的準(zhǔn)確位置較難限定，但一旦控制目標(biāo)性狀的某個 QTL 被確定為單個孟德爾因子后,，下一步的工作就與主基因沒有多大區(qū)別,。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道，作物 QTL 圖位克隆的基本程序可概括如下：首先利用初級作圖群體對所研究的數(shù)量性狀進(jìn)行 QTL 初步定位,，然后結(jié)合回交和分子標(biāo)記輔助選擇,，對目標(biāo) QTL 進(jìn)行前景選擇，同時進(jìn)行背景的負(fù)向選擇,，培育目標(biāo) QTL 的近等基因系 (Near-isogenic lines,，NILs)、染色體片段替換系 (Chromosome segment substitute lines,，CSSLs) 或?qū)胂?nbsp; (Introgressive lines,，ILs)，再利用這些材料構(gòu)建較大的次級分離群體,，在目標(biāo)區(qū)域設(shè)計特異性引物,，對 QTL 進(jìn)行精細(xì)定位，從而將目標(biāo) QTL 范圍縮小到一個很小的基因組區(qū)域,。在此基礎(chǔ)上,，可用染色體步移或著陸的方法構(gòu)建覆蓋目標(biāo)區(qū)域的克隆重疊群，鑒定出該座位上的候選基因,，并對候選基因序列特性和編碼產(chǎn)物進(jìn)行分析和預(yù)測,；最后通過表達(dá)分析和互補(bǔ)測驗等進(jìn)行功能驗證。下面以 Hd1 為例,，說明目前作物 QTL 克隆的具體步驟和方法,。
水稻中共有15個 QTL 與抽穗期有關(guān)，遺傳作圖將 Hd1 初步定位在控制光周期反應(yīng)的 Se1 基因所在區(qū)域,，因此認(rèn)為 Hd1 可能是 Se1 基因座的等位基因,，為了證實這一推測,，Yano 等采用圖位克隆法克隆了 Hd1。
第一步,，Hd1 的精細(xì)定位與覆蓋目標(biāo)區(qū)域重疊群的構(gòu)建：首先從秈稻品種 Nipponbare 和粳稻品種 Kassalath 構(gòu)建的 BC3F2 (Nipponbare 作輪回親本) 群體中選擇攜帶雜合 Hd1 區(qū)域,，其遺傳背景主要為 Nipponbare 的植株進(jìn)行自交，發(fā)展一個由9000個個體組成的分離群體 (BC3F3),；根據(jù)表型選擇1505個早熟極端個體 (在 Hd1 區(qū)域帶有純合的 Kassalath 等位基因)組成301個基因池,，檢測到 Hd1 與2個側(cè)翼標(biāo)記 R1679 和 P130 間的重組株分別為9個和2個，進(jìn)一步對這11個重組株用2個 RFLP 標(biāo)記 (C235 和 S2539) 和一個 CAPS 標(biāo)記 (S20481) 進(jìn)行分析,，將 Hd1 定位在 S20481 和 P130 之間；用 Hd1 兩側(cè)標(biāo)記篩選 YAC 庫 (RGP 用于構(gòu)建物理圖譜的基因組文庫),，發(fā)現(xiàn)2個克隆 Y4836 和 Y3955 包含3個側(cè)翼標(biāo)記 (C235,、S20481 和 S2539)，對 Y4836 克隆進(jìn)行末端克隆,，RFLP 分析表明,，其右末端 Y4836R 與 P130 共分離；繼續(xù)用 S20481,、S2539 和 Y4836R 篩選 Nipponbare 基因組 PAC 文庫,，獲得2個 PAC 克隆，其中 P0038C5 包括了 S20481,、S2539 和 Y4836R 三個標(biāo)記序列,，因此覆蓋了 Hd1 區(qū)域；進(jìn)一步對 P0038C5 測序,，根據(jù) S20481 和 Y4836R 的位置,，確定一個 26 kb 的范圍為 Hd1 的候選基因區(qū)域；利用候選基因區(qū)域序列資料設(shè)計了9個 CAPS 標(biāo)記,，并對這些標(biāo)記間及與 Hd1 之間的重組情況進(jìn)行分析,，最終將 Hd1 限定在一個 12 kb 的區(qū)域。
第二步,，Hd1 候選基因的序列分析和功能預(yù)測：用 Genscan 軟件分析候選基因區(qū)域的基因組序列,，預(yù)測該區(qū)域有2個可能的候選基因。BLAST 搜索非富余 DNA (Nonredundant DNA) 數(shù)據(jù)庫顯示,，其中第一個與擬南芥的 CONSTANS (CO) 基因有很高相似性,，而第二個就是 S2539，一種過氧化物酶的序列,，考慮到 CO 與擬南芥的光周期反應(yīng)有關(guān),，因此初步選擇第一個基因為候選基因進(jìn)行下一步序列分析；與 Nipponbare 相比,，Kassalath 在候選基因序列的第一個外顯子中存在4個單堿基替換,、1個雙堿基替換,、1個 36bp 堿基插入和1個 33bp 堿基缺失，而在第二個外顯子中有2個單堿基替換和1個雙堿基缺失,；對 se1 (水稻控制光周期反應(yīng)的1個主基因) 突變體 HS66 和 HS110 及其原始野生型品種 Ginbouzu 在 Hd1 第一候選基因區(qū)域的序列進(jìn)行比較,，也發(fā)現(xiàn)突變體 HS66 第一外顯子中有1個43個堿基的缺失，突變體 HS110 內(nèi)含子中有1個 433bp 的堿基插入,，這些結(jié)果表明 Hd1 與 Se1 是等位的,。對水稻的 Hd1 和擬南芥的 CO 進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)在鋅指域有59％的一致性,，而 C 端區(qū)一致性達(dá)79％,；從序列分析可知，水稻 Hd1 由2個外顯子組成,，編碼一個395個氨基酸組成的蛋白質(zhì),，是擬南芥 CO 基因家族的成員之一。Kassalath 等位基因由于第二個外顯子中的缺失形成提早終止密碼子,，結(jié)果形成沒有 C 端的蛋白產(chǎn)物,，導(dǎo)致功能的缺失。
第三步,，Hd1 候選基因的功能驗證：關(guān)鍵的實驗是轉(zhuǎn)基因功能互補(bǔ)測定,。將來自 Nipponbare 的一個包括 Hd1 候選基因的 7.1 kb DNA 片段轉(zhuǎn)移到一個 Nipponbare 的近等基因系中，該受體在 Hd1,、Hd2 座位含有純合的 Kassalath 等位基因,，表現(xiàn)對光周期鈍感，結(jié)果帶有 7.1 kb DNA 片段的轉(zhuǎn)化植株在短日照條件下較攜帶載體序列的轉(zhuǎn)化植株和受體提早抽穗,，對轉(zhuǎn)化植株后代表型分析也證明了包括 Hd1 候選基因的 7.1 kb DNA 片段具有光周期反應(yīng)敏感的功能,。RT-PCR 分析顯示，Hd1 的表達(dá)受光周期轉(zhuǎn)換的影響并不大,，這說明該基因的作用可能是通過影響那些受光周期直接調(diào)控的基因的表達(dá)來實現(xiàn)的,。
2.3 作物 QTL 圖位克隆方法的不足
目前所有作物 QTL 的克隆基本上都是按照以上的方法和步驟進(jìn)行的，整個過程涉及遺傳圖譜,、物理圖譜的構(gòu)建,；基因組文庫或 cDNA 文庫的建立與篩選；近等基因系等群體的選育以及 DNA 測序,、基因表達(dá)分析和互補(bǔ)測驗等,。這些環(huán)節(jié)的工作是比較復(fù)雜的，所花費(fèi)的人力,、物力和時間也是很多,。 Tanksley 實驗室從20世紀(jì)80年代末開始研究番茄果實重量的數(shù)量遺傳規(guī)律，1996年把 fw2.2 定位到第2染色體的約 150 kb 的區(qū)域,，在2000年完成了克隆工作,，前后花了10多年的時間,；以色列的 Zamir 研究小組在1995年把1個控制番茄糖度的 QTL Brix9-2-5 定位在第9染色體上大約 9 cM 區(qū)域，2000年最終將其鑒定為 Lin5 基因(細(xì)胞質(zhì)外蔗糖轉(zhuǎn)化酶),，也經(jīng)歷了6年的時間,。由于傳統(tǒng) QTL 圖位克隆工作的難度，目前這方面雖然取得了突破,，但無論是涉及到的作物種類,、性狀類型還是 QTL 的數(shù)量都是很有限的，尤其一些效應(yīng)較小的 QTL 還沒有被克隆出來,。
3 作物數(shù)量性狀基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展
近年來植物基因組研究進(jìn)展非常迅速,，尤其擬南芥、水稻等模式植物高密度遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建,、全基因組序列的公布,、數(shù)以萬計 EST、全長 cDNA 等序列及功能分析數(shù)據(jù)的釋放以及新型植物分子標(biāo)記及其高效檢測技術(shù)的發(fā)展等,，為基因的圖位克隆帶來了新的思路和方法。Jander 等對擬南芥基因的圖位克隆效率進(jìn)行了分析,，對比結(jié)果,，1995年克隆1個基因大約需要3～5人年，而2002年后則不到1人年(擬南芥年繁殖5～6代),。同時這些新的進(jìn)展也能夠使 QTL 的精細(xì)定位和物理圖譜構(gòu)建等相關(guān)工作大大簡化,，因此同樣可促使 QTL 的圖位克隆向更加簡便、快速的方向發(fā)展,。 3.1 作物 QTL 精細(xì)定位方法
傳統(tǒng)圖位克隆中的關(guān)鍵限制步驟是 QTL 的精細(xì)定位和通過染色體步移獲得目的 QTL 區(qū)域的物理圖譜,，這一過程相當(dāng)費(fèi)時、費(fèi)力?，F(xiàn)在公共數(shù)據(jù)庫中大量的序列資料為這一工作的順利完成提供了便利,。比如，當(dāng)水稻某一 QTL 初步定位在2個標(biāo)記之間后,，就可以從國際水稻基因組測序計劃 (IRGSP) 公布的序列中下載這2個標(biāo)記區(qū)域的部分 PAC/BAC 克隆序列,，利用軟件 SSRIT 搜索克隆序列中的微衛(wèi)星序列，然后選擇合適的微衛(wèi)星序列進(jìn)行特異 PCR 引物的設(shè)計,；也可以直接借助于公共數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行比較,，如尋找 RGP 數(shù)據(jù)庫(粳稻)與中國華大數(shù)據(jù)庫(秈稻)的序列差異，設(shè)計單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 標(biāo)記和缺失/插入多態(tài) (Del/In) 標(biāo)記等,，利用這些標(biāo)記對大群體進(jìn)行分析,，可以迅速地將目標(biāo) QTL 范圍縮小到一個很小的基因組區(qū)域。在完成精細(xì)定位后,，可以根據(jù)已有的與目標(biāo) QTL 緊密連鎖的分子標(biāo)記在已公布 RGP 物理圖譜上的位置,，通過序列的拼接,，實現(xiàn)目標(biāo) QTL 區(qū)域遺傳圖譜和物理圖譜的電子整合，很快得到該區(qū)域的基因組序列,，從而可以減少文庫構(gòu)建,、篩選等繁重的工作，加速 QTL 的克隆進(jìn)程,。近來還有些學(xué)者提出一種更加簡單的“高爾夫球逼近法” (Genegolfing) 進(jìn)行基因克隆,，其做法是從與目標(biāo)性狀松散連鎖的分子標(biāo)記出發(fā)，把標(biāo)記與基因間的遺傳距離換算成物理距離,，“一桿”即能到達(dá)可能包括目標(biāo)基因的重疊群,，再從該連鎖群中分離單拷貝序列作為探針或設(shè)計引物，對目標(biāo)基因重新定位,，如果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因不在該重疊群上,，則可繼續(xù)“第二桿”，反復(fù)如此,，直至分離到含有目標(biāo)基因的克隆為止,。不過這種方法能否用于 QTL 克隆，還需實踐驗證,。
3.2 作物 QTL 圖位克隆的作圖群體
在作圖群體方面,，近等基因系、染色體片段替換系或?qū)胂凳侵参?nbsp; QTL 克隆的關(guān)鍵基礎(chǔ)材料,。目前,，水稻、番茄和油菜等作物已建立了多個染色體代換系群體,，但大多數(shù)代換系群體的供體較少,，且每個代換系含有多個片段，有些覆蓋率也不高,，因此 QTL 鑒定效率不高,。本實驗室以24個水稻品種為供體，利用回交和微衛(wèi)星標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法,，建立了以秈稻品種華粳秈74為背景的水稻單片段代換系 (Single segment substitution lines,，SSSLs) 群體，目前獲得的單片段代換系已超過1000個,，覆蓋了整個水稻基因組,。由于單片段代換系是用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)建立的近等基因系，在每個單片段代換系的基因組內(nèi)都只有來自供體親本的一個純合染色體片段,，而基因組的其余部分與受體親本相同,，所有在單片段代換系與其受體親本之間的差異以及在單片段代換系之間所有可遺傳的變異都只與代換片段相聯(lián)系。單片段代換系在 QTL 的鑒定與定位、克隆及功能研究方面具有重要的利用價值,。第一,，利用覆蓋全基因組的單片段代換系群體可以實現(xiàn)對目標(biāo)性狀進(jìn)行全基因組的 QTL 鑒定，全面了解重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎(chǔ)，席章營用326個單片段代換系在兩季共檢出24個農(nóng)藝性狀的701個 QTL，平均每個性狀檢出了29.21個 QTL ,；第二，由于消除了遺傳背景的干擾,，QTL 的效應(yīng)被相對“放大”，如在常規(guī)分離群體中,，fw2.2 對番茄果重變異的貢獻(xiàn)為5％～30％,，而在 NILs 發(fā)展的 F2 群體中其作用達(dá)到47％，這樣就從遺傳和統(tǒng)計兩個方面保證了 QTL 定位的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,；第三,，在鑒定出 QTL 后可以立即通過相關(guān)的單片段代換系與受體雜交發(fā)展大樣本的分離群體進(jìn)行 QTL 精細(xì)定位，也可以通過進(jìn)一步的回交和分子標(biāo)記輔助選擇選育次級單片段代換系,，并通過重疊作圖的方法進(jìn)一步縮小 QTL 區(qū)域,；第四，在候選基因確定后,，還可設(shè)計引物擴(kuò)增候選基因區(qū)域,，測序后通過對不同供體來源的單片段代換系在同一基因組區(qū)域的序列和表型差異進(jìn)行比較，尋找變異位點(diǎn),，并對候選基因功能進(jìn)行驗證，擬南芥中一些基因的功能就是通過這種方法研究的,。此外,，單片段代換系之間的相互雜交還可以研究 QTL 之間的遺傳互作；單片段代換系與其他品種雜交可以研究 QTL 與不同遺傳背景的互作,。
4 結(jié)論
自 Peterson 等首次對 QTL 進(jìn)行全基因組掃描以來,，已有許多學(xué)者用不同的作圖群體，采用不同的統(tǒng)計分析方法定位了許多作物 QTL,，但其中只有很少幾種作物的幾個效應(yīng)較大的 QTL 被克隆,。原因主要有二，一是數(shù)量性狀基因表達(dá)非常復(fù)雜,，用現(xiàn)有作圖方法(包括遺傳模型,、作圖群體等)對 QTL 的定位能力有限，難以獲得 QTL 的正確位置,；二是傳統(tǒng)的克隆方法過于復(fù)雜和困難,。近年來在植物基因組學(xué)研究領(lǐng)域所取得的成果無疑將大大促進(jìn) QTL 的克隆研究。QTL 的鑒定和分離已成為21世紀(jì)遺傳學(xué)研究的主要方向之一，同時也是后基因組學(xué)的重要任務(wù),，相信隨著相關(guān)研究的不斷深入,，在不久的將來，主要農(nóng)作物會有更多新的 QTL 被克隆,。
注：
（1）參考文獻(xiàn)：略,；需者可與本站Email聯(lián)系，或到中國水稻研究所圖書館查閱,；
（2）文章來源：植物遺傳資源學(xué)報,，2005年 第6卷第4期；
（3）作者單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)/廣東省植物分子育種重點(diǎn)實驗室,。
