2010年12月9日，我所王曉晨實(shí)驗(yàn)室在PLoS Genetics雜志在線發(fā)表題為“Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1”的文章,。該文章首次報(bào)道了秀麗線蟲(chóng)磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1通過(guò)維持磷脂酰絲氨酸在內(nèi)涵體膜上的不對(duì)稱性分布從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)有效的內(nèi)吞分選(endocytic sorting)及循環(huán)(recycling)過(guò)程。
早期內(nèi)涵體(early endosome)是細(xì)胞內(nèi)的“貨物分選站”。內(nèi)吞分選是早期內(nèi)涵體(early endosome)通過(guò)形成若干形態(tài)與功能各異的亞結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)的,。已知需要被循環(huán)利用的蛋白如某些受體等在早期內(nèi)涵體將被分選而轉(zhuǎn)運(yùn)到新形成的管狀膜泡上,，從而回到細(xì)胞膜上繼續(xù)行使其功能，而這種內(nèi)吞循環(huán)過(guò)程中的管狀膜泡的形成是如何被調(diào)控的還知之甚少,。我們的工作表明,，秀麗線蟲(chóng)磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1對(duì)于這種管狀膜泡的形成至關(guān)重要，而該功能很有可能是通過(guò)維持早期內(nèi)涵體膜上磷脂酰絲氨酸的不對(duì)稱性分布而實(shí)現(xiàn)的,。
我們從一個(gè)調(diào)控凋亡信號(hào)磷脂酰絲氨酸外翻缺陷的遺傳篩選中得到了編碼磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAT-1及其分子伴侶CHAT-1的功能失活突變體,。TAT-1屬于P類(lèi)ATP水解酶家族，這類(lèi)蛋白與生物膜上磷脂酰脂類(lèi)的分布調(diào)控相關(guān),。在野生型的凋亡細(xì)胞表面可以檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸的暴露,，這是凋亡細(xì)胞早期最顯著的凋亡信號(hào)，而在活細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸都被限制在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),。在tat-1和chat-1突變體中,，在凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞表面我們都可以檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸，這與之前薛定實(shí)驗(yàn)室關(guān)于TAT-1的研究結(jié)果是一致的,。我們發(fā)現(xiàn)TAT-1與CHAT-1在多種細(xì)胞類(lèi)型中共定位,，在亞細(xì)胞水平上，它們?cè)诩?xì)胞膜和細(xì)胞器膜上也共定位,。進(jìn)一步研究表明,，它們需要彼此才能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞器膜和細(xì)胞膜上執(zhí)行功能。這是首次對(duì)秀麗線蟲(chóng)中TAT-1分子伴侶CHAT-1的研究報(bào)道,。
這兩個(gè)突變體除了具有磷脂酰絲氨酸在活細(xì)胞表面暴露的表型之外,，研究發(fā)現(xiàn)在幼齡四期線蟲(chóng)及成蟲(chóng)的腸系細(xì)胞中累積了很多異常變大的膜泡,。通過(guò)一系列內(nèi)吞系統(tǒng)的分子標(biāo)記分析表明這些膜泡上具有早期內(nèi)涵體蛋白R(shí)AB-5，晚期內(nèi)涵體與早期溶酶體蛋白R(shí)AB-7,，以及循環(huán)內(nèi)涵體蛋白R(shí)AB-10和RAB-11,。hTfR、hTAC和GLUT1(線蟲(chóng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受體)是細(xì)胞膜表面受體,，在野生型中這些蛋白在內(nèi)吞發(fā)生后會(huì)較快地被轉(zhuǎn)運(yùn)回到細(xì)胞膜上,，因此它們主要定位在細(xì)胞膜上，而在突變體中這些蛋白很大比例滯留在細(xì)胞中,，細(xì)胞膜上的定位大大減少,。線蟲(chóng)通過(guò)降解卵黃蛋白為發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，突變體的胚胎和成蟲(chóng)與同時(shí)期野生型相比,，有明顯的卵黃蛋白降解缺陷,。此外，在腸系細(xì)胞中有較多的細(xì)胞自噬(autophagy)蛋白LGG-1聚積,，表明細(xì)胞自噬的降解可能也有缺陷,。
為了深入研究為何突變體中存在內(nèi)吞循環(huán)缺陷和降解缺陷，我們檢測(cè)了TAT-1和CHAT-1在腸系細(xì)胞中的亞細(xì)胞水平定位,。TAT-1和CHAT-1主要定位在細(xì)胞膜,，早期內(nèi)涵體及管狀膜泡的細(xì)胞器膜上。與RAB-5,、RAB-10和RAB-11的共定位研究表明這些管狀膜泡是從早期內(nèi)涵體發(fā)出的循環(huán)內(nèi)涵體,。已知RAB-10促進(jìn)循環(huán)內(nèi)涵體的生成，RME-1促進(jìn)循環(huán)內(nèi)涵體頂端形成球狀膜泡并脫離管狀膜泡,。在rab-10突變體中,，觀察不到CHAT-1標(biāo)記的管狀膜泡；而在rme-1突變體中,，管狀膜泡比野生型中更加明顯。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TAT-1和CHAT-1標(biāo)記的管狀膜泡是循環(huán)內(nèi)涵體,。檢測(cè)CHAT-1和GLUT1的共定位發(fā)現(xiàn),，二者在管狀結(jié)構(gòu)上很好的共定位，表明CHAT-1所標(biāo)記的循環(huán)內(nèi)涵體上具有循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)GLUT1的功能,。在tat-1和chat-1突變體中,，觀察不到這種GLUT1標(biāo)記的管狀膜泡，與此同時(shí)GLUT1很大比例無(wú)法被循環(huán)運(yùn)送到細(xì)胞膜上,。
已有研究表明,，TAT-1負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸不對(duì)稱性分布。而細(xì)胞器膜上磷脂酰絲氨酸是否不對(duì)稱性分布,，如果不對(duì)稱性分布,，那么是否由TAT-1調(diào)控均無(wú)研究報(bào)道,。通過(guò)特異結(jié)合磷脂酰絲氨酸的LACT-C2分子標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)在腸系細(xì)胞包括早期內(nèi)涵體,、循環(huán)內(nèi)涵體在內(nèi)的多種細(xì)胞器膜外表面有磷脂酰絲氨酸分布,。線蟲(chóng)六個(gè)假體腔細(xì)胞有較大的內(nèi)涵體和溶酶體，我們通過(guò)分泌的LACT-C2發(fā)現(xiàn)野生型內(nèi)涵體膜內(nèi)側(cè)無(wú)磷脂酰絲氨酸分布,，而tat-1和chat-1突變體中能檢測(cè)到,！以上結(jié)果表明，磷脂酰絲氨酸在內(nèi)涵體膜上是不對(duì)稱性分布的,，而這種不對(duì)稱性分布是由TAT-1和CHAT-1參與調(diào)控的,。這是關(guān)于內(nèi)涵體膜磷脂酰絲氨酸不對(duì)稱性分布及其調(diào)控的首次研究報(bào)道。我們認(rèn)為,，TAT-1和CHAT-1維持了內(nèi)涵體上磷脂酰絲氨酸的不對(duì)稱性分布,，而這種不對(duì)稱性分布對(duì)于細(xì)胞內(nèi)有效的內(nèi)吞分選和循環(huán)是至關(guān)重要的。
我所與北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院聯(lián)合培養(yǎng)的博士生陳寶惠為本文的第一作者,，其它作者還有姜岳,、曾勝、晏家驄,、李欣,、張燕和鄒煒。王曉晨博士為本文通訊作者,。此項(xiàng)研究由科技部863計(jì)劃和北京市科委資助,，在北京生命科學(xué)研究所完成。（生物谷Bioon.com）
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PLoS Genetics doi:10.1371/journal.pgen.1001235
Endocytic Sorting and Recycling Require Membrane Phosphatidylserine Asymmetry Maintained by TAT-1/CHAT-1
Baohui Chen1,2, Yue Jiang2, Sheng Zeng2, Jiacong Yan2, Xin Li2, Yan Zhang2, Wei Zou2, Xiaochen Wang2*
1 Graduate Program in Chinese Academy of Medical Sciences and Peking union Medical College, Beijing, China, 2 National Institute of Biological Sciences, Beijing, China
Abstract
Endocytic sorting is achieved through the formation of morphologically and functionally distinct sub-domains within early endosomes. Cargoes destined for recycling are sorted to and transported through newly-formed tubular membranes, but the processes that regulate membrane tubulation are poorly understood. Here, we identified a novel Caenorhabditis elegans Cdc50 family protein, CHAT-1, which acts as the chaperone of the TAT-1 P4-ATPase to regulate membrane phosphatidylserine (PS) asymmetry and endocytic transport. In chat-1 and tat-1 mutants, the endocytic sorting process is disrupted, leading to defects in both cargo recycling and degradation. TAT-1 and CHAT-1 colocalize to the tubular domain of the early endosome, the tubular endocytic recycling compartment (ERC), and the recycling endosome where PS is enriched on the cytosolic surface. Loss of tat-1 and chat-1 function disrupts membrane PS asymmetry and abrogates the tubular membrane structure. Our data suggest that CHAT-1 and TAT-1 maintain membrane phosphatidylserine asymmetry, thus promoting membrane tubulation and regulating endocytic sorting and recycling.
