器官移植教育部重點實驗室（華中科技大學）
華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所,，武漢 430030
摘要 小鼠和人類體內的調節(jié)性T細胞介導機體特異性免疫耐受，能抑制自身免疫性疾病,，并介導腫瘤免疫和器官移植免疫,。最近發(fā)現轉錄因子Foxp3基因及其編碼產物scurfin參與調節(jié)性T細胞的中樞性和外周性生成過程,，并影響調節(jié)性T細胞免疫調節(jié)功能的發(fā)揮。CD4+T細胞表面表達的scurfin可能是調節(jié)性T細胞的特異性標記,。而轉導了Foxp3mRNA的細胞表達scurfin后,，部分表現出免疫調節(jié)功能。
關鍵詞 Foxp3 scurfin 調節(jié)性T細胞 免疫耐受
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高等動物的免疫系統(tǒng)能夠保護機體免受病原微生物的侵害,，并可通過一系列復雜的中樞以及外周免疫機制形成針對自身抗原的免疫耐受,，從而避免免疫系統(tǒng)對自身抗原進行攻擊。具有抑制功能的調節(jié)性T細胞即在免疫耐受的形成過程中發(fā)揮重要作用
二十世紀七十年代,，有學者發(fā)現有一群T細胞可介導機體特異性免疫抑制1,。但由于沒有找到明確的表面標記，這方面的研究進展緩慢,。直到1995年,，Sakaguchi等發(fā)現給nu/nu小鼠輸注清除了CD4+CD25+雙陽性細胞亞群的CD4+細胞會引起器官特異性自身免疫性疾病的發(fā)生；而同時輸注CD4+CD25+細胞可以避免這種自身免疫性疾病的發(fā)生2,。這一發(fā)現,，為當時調節(jié)性T細胞的研究提供了一個可靠的表面標志。近十年,，隨著對CD25,、CTLA-4和TGF-β這些與調節(jié)性T細胞鑒別和功能密切相關的分子研究的深入3,4，人們開始關注調節(jié)性T細胞在維持機體免疫耐受狀態(tài)，防止自身免疫病的發(fā)生,，抗移植物排斥以及腫瘤免疫中的重要作用2,19,。
然而，調節(jié)性T細胞的特異性表面標記一直是爭論的焦點之一,，因為部分CD4+CD25-T細胞也具有免疫抑制功能5,，同時CD25和CTLA-4也是細胞活化的標記，并非調節(jié)性T細胞所獨有的表面標志,。
調節(jié)T的生物學特性
近期有研究表明,， Foxp3基因編碼的產物可能對調節(jié)性T細胞的生長以及功能發(fā)揮起重要作用6,7,8。而且,，Foxp3并非細胞活化的表面標記,，而是具有免疫抑制功能的細胞所共有的標記。
1.Foxp3研究簡史
Foxp3基因的編碼產物為一個48-kDa的蛋白質scurfin,，其特征性結構為蛋白C端的叉頭螺旋（forkhead/winged helix）結構,，這一結構域內的蛋白質屬于DNA結合因子家族成員之一。除了叉頭區(qū),，scurfin還包括一個C2H2鋅指結構以及亮氨酸拉鏈序列,，但是沒有磷酸化的PKB/AKT位點13。scurfin屬于轉錄調節(jié)子,，主要作用是抑制轉錄,，主要表達于淋巴組織的CD4+T細胞，但在CD8+細胞和B細胞則基本上不表達17,。體外實驗表明,，scurfin以IL-2依賴的受體作為轉錄阻遏物，但是體內確切的靶點仍不清楚,。
在scurfy（sf）缺陷的突變小鼠內可以觀察到CD4+T細胞相關淋巴細胞增生病,這種疾病是由于Foxp3的編碼產物scurfin功能缺失造成的,，其表現與缺乏CTLA-4以及TGF-β的小鼠相似18。
2001年,，Wildin 和Bennett 同時提出人類Foxp3基因與sf突變小鼠的Foxp3基因具有同源性9,10,，該基因突變引起免疫失調性基因疾病、多發(fā)性內分泌腺體病,、小腸免疫性疾病,、X－相關綜合癥（IPEX；也稱為X－相關自身免疫性變應性失調綜合癥,，XLAAD）等,，這些疾病的一個共同特征就是整體免疫失調。
隨后,，Roli K等發(fā)現,，scurfin高表達的小鼠免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)11。將Foxp3基因導入小鼠后發(fā)現，T細胞數量明顯減少,，低于正常水平,，并且這些T細胞的增殖能力和溶細胞能力均較低，在TCR的刺激下分泌的IL-2水平降低,。雖然這類小鼠的胸腺發(fā)育正常,，但是其外周免疫器官，尤其是淋巴結,，表現出無細胞狀態(tài),。這說明Foxp3影響了小鼠外周免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能狀態(tài)。 2003年,，Hori S等幾乎同時發(fā)現6,7,8,，Foxp3和調節(jié)性T細胞的發(fā)育和功能相關,。因此,，O'Garra A將Foxp3稱為"21世紀的Foxp3"。12
2. Foxp3與調節(jié)性T細胞的關系
2.1 scurfin在調節(jié)性T細胞特異性表達
Fontenot使用PCR技術和western blot技術,，分別證實了Foxp3mRNA和scurfin蛋白在正常小鼠體內的CD4+CD25+T細胞比CD4+CD25-T細胞高,。從而考慮Foxp3在調節(jié)性T細胞表達具有特異性。
通過向患有淋巴細胞減少癥的小鼠體內輸入轉導了Foxp3的CD4+CD25-T細胞發(fā)現,，這些細胞不但沒有誘導出消耗性疾病,，反而抑制了供者CD8分子的增殖，進一步證實了Fxop3在調節(jié)性T細胞獲得其調節(jié)功能的過程中起重要作用,。隨后從受者體內分離這些表達scurfin的細胞進行檢測,，發(fā)現它們高表達IL-10mRNA，這與CD4+CD25+調節(jié)性T細胞特性相同,。Hori等證實6,，轉導了Foxp3的 CD4+CD25-T細胞同樣可以抑制淋巴細胞增生小鼠的炎性腸病（IBD）以及胃炎的發(fā)生,，且在體外可以抑制初始T細胞增殖,。然而，在這個實驗中,，即使在導入受者小鼠體內之前給Foxp3轉導細胞以抗CD3的刺激,， 分泌的IL-10也很低。這說明Tr細胞高IL-10mRNA表達的機制非常復雜,，或者這是只在體內才具有的特征,。
然而，有研究表明使用TCR和CD28的抗體刺激不能誘導出小鼠CD4+CD25+T和CD4+CD25-的Foxp3mRNA產生,，說明它并非細胞活化的標志,。這就將scurfin從其他可能的調節(jié)性T細胞的表面標志如CD25，GITR分開，因為那些標志也在活化細胞表面表達,。
2.2 Foxp3和scurfin對調節(jié)性T細胞功能的作用
Roli K等的研究指出,，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD4+T細胞中均有一個細胞亞群表達CD25分子的同時大量表達CD69，但是正常小鼠的調節(jié)性T細胞僅表達CD25而不高表達CD69分子,。在體外培養(yǎng)中,，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD25+細胞在刺激下均能增殖，且不具有調節(jié)活性,。因此上述兩種小鼠體內T細胞 CD25的表達是伴隨著淋巴細胞增生失調的細胞活化的結果,，并非一個調節(jié)性亞群細胞的標志。此外,，Rudensky等發(fā)現向新生的scurfy小鼠輸入CD4+CD25+T細胞可以預防這種淋巴細胞增生失調的發(fā)生,，說明由Foxp3缺失導致CD4+CD25+T細胞的不足是引起淋巴細胞增生失調的關鍵。
Foxp3的mRNA表達和調節(jié)性T細胞的相關性說明了兩者在功能上有一定關聯,。缺乏功能性Foxp3基因的小鼠和人都會發(fā)生自身免疫性疾病,，說明Foxp3在控制T細胞活化中起到重要作用。為了直接證實這一點,，許多實驗組都使非調節(jié)性T細胞表達Foxp3,，隨后檢測它們的表型及功能。使用逆轉錄病毒轉導Foxp3或者在轉基因動物模型中高表達scurfin,，其結果均顯示在體外獲得了表面不具有CD25分子但是具有調節(jié)性T細胞功能的細胞,，其中包括CD8＋細胞。但是這些細胞的抑制能力與Foxp3的數量并不成正比,，說明Foxp3在細胞獲得抑制作用的過程中起了重要作用,，但是細胞僅有Foxp3不足以表現出其抑制功能。
Devorah等使用轉基因高表達scurfin的小鼠模型（Foxp3 Tg小鼠）研究15,，發(fā)現其成熟性,、功能性T細胞數目較正常小鼠低。使用T細胞依賴抗原免疫的這類小鼠的血清里抗原特異性Ig數目減少,，脾臟結構混亂,。而在體外培養(yǎng)實驗中，B細胞的應答正常,，說明該類小鼠抗體低應答緣自體內T細胞輔助功能缺陷,。而這類小鼠的CD4+T細胞CD40配體數目下調，分泌IFN－γ數量也減少,。這說明高表達scurfin的小鼠體內的CD4+T不能提供輔助B細胞對T細胞依賴抗原應答的信號,。
2.3 Foxp3和調節(jié)性T細胞的生成關系
非調節(jié)性T細胞表達Foxp3后也能抑制體內的自身免疫疾病發(fā)生。Foxp3相關細胞的一個重要特征是組成性表達CD25和GITR,，這與天然調節(jié)性CD4+CD25+T細胞相同,。在Fontenot等構建的混合骨髓嵌合體模型中,，即有Foxp3＋細胞，也有Foxp3null細胞,，這說明所有的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞都是源自Foxp3基因,。因此，Foxp3可以調控調節(jié)性T細胞的生成,。
由于表達Foxp3的CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25-T細胞均可以抑制體外TCR刺激下的T細胞活化和擴增4,5,6,，人們考慮了兩種可能的CD4+CD25+T細胞發(fā)源途徑：①在TCR刺激下，初始T細胞可以分化為CD4+CD25+調節(jié)性T細胞,，這一途徑可能類似于轉導因子T-bet和GATA-3誘導初始細胞分化為Th1,，Th2；②胸腺產生的一部分功能成熟的調節(jié)性T細胞為CD4+CD25-T細胞,，或者胸腺來源的CD4+CD25+T細胞失表達CD25分子后,，還保留了其抑制功能14。
Hori和Khattri的數據表明,，高表達Foxp3的細胞與Foxp3陰性細胞相比,，對T細胞的刺激反應較低，這主要表現在細胞反應性增殖以及IL-2,、IL-10的產生上,。而在混合骨髓嵌合體模型的細胞細胞中，卻發(fā)現表達Foxp3的CD4+CD25-T細胞在TCR刺激下正常增殖,，且有數據表明Foxp3的表達與IL-10mRNA數目增加相關。這一T細胞功能的差異是與Foxp3表達數目相關,，還是與細胞純化手段或者與體內細胞分化相關,，目前尚不清楚。值得注意的是逆轉錄病毒轉導細胞和Foxp3轉基因細胞在體外不能如同天然CD4+CD25+調節(jié)性T細胞一樣高效率的抑制CD4+CD25-T細胞增殖,，這可能與這一群細胞的異質性有關,，因為在本實驗系統(tǒng)中無法確定所有表達Foxp3的細胞都是天然CD4+CD25+調節(jié)性T細胞。因此Foxp3基因的存在可以指揮細胞發(fā)育成調節(jié)性T細胞譜系,，但這些細胞的最佳功能尚需要其他的因素進行調控,。
現在已經證實人體內的CD4+CD25+T細胞部分表達Foxp3，并且Foxp3+的這群細胞具有免疫抑制功能,。但與小鼠不同的是,，使用TCR和抗CD28單抗聯合刺激CD4+CD25-T細胞，生成的CD4+CD25+T細胞表達Foxp3,，這些細胞也具有調節(jié)性T細胞的抑制性功能16,。
3．影響scurfin生成的因素
誘導Foxp3基因表達的因素以及可以表達這個基因的細胞群，可以決定調節(jié)性T細胞生成的機制,。CD4+CD25+T細胞在胸腺選擇的過程中,，Foxp3的mRNA可以由TCR的交互作用來直接控制Foxp3的表達,。此外，胸腺APC細胞,，如表達AIRE的胸腺髓質上皮細胞就可能跟CD4+CD25+調節(jié)性T細胞生成有關,。但調節(jié)性T細胞內的Foxp3+亞群是否也有在外周生成途徑，以及哪些因素可控制這一過程,，目前仍不清楚,。在胸腺發(fā)育過程中這一基因的表達產物不足以抑制其他Foxp3null動物的疾病。這說明對于維系調節(jié)性T細胞的功能,，Foxp3在外周的繼發(fā)表達也很重要,。
盡管Foxp3對于調節(jié)性T細胞活性的作用令人關注，但這是否是Foxp3編碼產物scurfin的唯一功能尚不清楚,。高表達Foxp3的CD4+T細胞對于刺激有高反應性,，且在分泌細胞因子上有缺陷，這說明了它們在免疫抑制作用上并非最佳,。此外在轉基因鼠內,，Foxp3mRNA的數目與外周的調節(jié)性T細胞數目直接相關。這說明了調節(jié)性T（Foxp3+）細胞擴增能力受到自穩(wěn)狀態(tài)的限制,，或者說明Foxp3編碼產物對T細胞擴增發(fā)揮直接作用,。因為Foxp3null和CTLA-4null小鼠表現出非常相似的表型，轉基因表達的Foxp3盡管并不能完全抑制疾病發(fā)生,，但可以延遲CTLA－4null小鼠的致死性變化,。這些CTLA－4null/Foxp3轉基因小鼠的Tr細胞可以延遲疾病，說明CTLA-4信號和Foxp3信號也有一定聯系,。
4.小結
Foxp3和調節(jié)性T細胞的發(fā)生,、功能間的聯系為我們在分子水平研究機體內這一特殊細胞群提供了依據，而Foxp3基因的表達產物在調節(jié)性T細胞表面的表達,，則為我們研究調節(jié)性T細胞,，提供了一個可能的特異性標記。Foxp3與介導調節(jié)性T細胞的一系列細胞因子,，如CTLA-4,、GITR、IL-10和TGF-β等的功能作用有著千絲萬縷的聯系,。轉Foxp3基因進入細胞誘導產生具有調節(jié)功能的細胞,，則為我們把調節(jié)性細胞用于臨床免疫治療提供了一種可能。但是Foxp3基因在調節(jié)性T細胞的中樞,、外周發(fā)育途徑中究竟起了什么作用,，它是如何參與調節(jié)性T細胞的功能發(fā)揮，以及轉導Foxp3的基因是否能作為治療自身免疫病的發(fā)生和抗移植物排斥,、抗腫瘤免疫逃避的一條新途徑,，還有待進一步研究,。
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Reference
1 Gershon RK, Kondo K. Cell interactions in the induction of tolerance: the role of thymic lymphocytes. Immunol, 1970,18:723-737.
2 Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor a-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol, 1995, 155:1151-1164.
3 Graca L, Thompson S, Lin CY, Adams E. Cobblod S.P. and Waldmann H. Both CD4+CD25+ and CD4+CD25-T Regulatory Cells Mediate Dominant Transplantation Tolerance. J Immunol, 2002, 168:5558-5565
4. Wildin RS, Ramsdell F, Peake J, Faravelli F, Casanova JL, Buist N, Levy-Lahad E, Mazzella M, Goulet O, Perroni L, Bricarelli FD, Byrne G, McEuen M, Proll S, Appleby M, Brunkow ME. X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy.
Nat Genet. 2001 Jan;27(1):18-20.
5. Bennett CL, Christie J, Ramsdell F, Brunkow ME, Ferguson PJ, Whitesell L, Kelly TE, Saulsbury FT, Chance PF, Ochs HD. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3.
Nat Genet. 2001 Jan;27(1):20-1.
6. Khattri R, Kasprowicz D, Cox T, Mortrud M, Appleby MW, Brunkow ME, Ziegler SF, Ramsdell F. The amount of scurfin protein determines peripheral T cell number and responsiveness.
J Immunol. 2001 Dec 1;167(11):6312-20.
7. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 2003 Feb 14;299(5609):1057-61.
8. Fontenot, J.D., Gavin, M.A. & Rudensky, A.Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat. Immunol. 4, 330-336 (2003).
9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S.-A. & Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat. Immunol. 4, 337-342 (2003).
10. O'Garra A, Vieira P. Twenty-first century Foxp3. Nat Immunol. 2003 Apr;4(4):304-6.
11 Sakaguchi SThe origin of FOXP3-expressing CD4+ regulatory T cells: thymus or periphery.
J Clin Invest. 2003 Nov;112(9):1310-2.
12. Kasprowicz DJ, Smallwood PS, Tyznik AJ, Ziegler SF. Scurfin (FoxP3) controls T-dependent immune responses in vivo through regulation of CD4+ T cell effector function.
J Immunol. 2003 Aug 1;171(3):1216-23.
13 Walker MR, Kasprowicz DJ, Gersuk VH, Benard A, Van Landeghen M, Buckner JH, Ziegler SF. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. J Clin Invest. 2003 Nov;112(9):1437-43
14．Schubert LA, Jeffery E, Zhang Y, Ramsdell F, Ziegler SF. Scurfin (FOXP3) acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation. J Biol Chem. 2001 Oct 5;276(40):37672-9.
15 Takahashi T, et al. Immunologic self tolerance maintained by CD4+CD25+ regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J Exp Med, 2000, 192:303-310.
16. Piccirillo CA, Letterio JJ, Thornton AM, McHugh RS, Mamura M, Mizuhara H,
Shevach EM. CD4+CD25+ Regulatory T Cells Can Mediate Suppressor Function in the Absence of Transforming Growth Factor beta1 Production and Responsiveness. J Exp Med, 2002 ,196(2):237-246
17. Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA, Paeper B, Clark LB, Yasayko SA, Wilkinson JE, Galas D, Ziegler SF, Ramsdell F. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat Genet. 2001 Jan;27(1):68-73.
18. M.F.Lyon, J.Peters, P.H.Glenister, et al. The scurfy mouse mutant has previously unrecognized hematological abnormalities and resembles WiskottAldrich syndrome. Proc. Natl. Scad. Sci. 1990 April;(87):2433-2437
19. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Shimizu J, Yamazaki S, Sakihama T, Itoh M, Kuniyasu Y, Nomura T, Toda M, Takahashi T. Immunologic tolerance maintained by CD4+CD25+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance. Immunol Rev, 2001, 182:18-32
