器官移植教育部重點實驗室（華中科技大學(xué)）
華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所，武漢 430030

摘要 小鼠和人類體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)機體特異性免疫耐受，能抑制自身免疫性疾病，并介導(dǎo)腫瘤免疫和器官移植免疫,。最近發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3基因及其編碼產(chǎn)物scurfin參與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的中樞性和外周性生成過程，并影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮。CD4+T細(xì)胞表面表達的scurfin可能是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)記,。而轉(zhuǎn)導(dǎo)了Foxp3mRNA的細(xì)胞表達scurfin后，部分表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)功能,。

關(guān)鍵詞 Foxp3 scurfin 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 免疫耐受

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高等動物的免疫系統(tǒng)能夠保護機體免受病原微生物的侵害,，并可通過一系列復(fù)雜的中樞以及外周免疫機制形成針對自身抗原的免疫耐受，從而避免免疫系統(tǒng)對自身抗原進行攻擊,。具有抑制功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞即在免疫耐受的形成過程中發(fā)揮重要作用
二十世紀(jì)七十年代,，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)有一群T細(xì)胞可介導(dǎo)機體特異性免疫抑制1。但由于沒有找到明確的表面標(biāo)記,，這方面的研究進展緩慢,。直到1995年,，Sakaguchi等發(fā)現(xiàn)給nu/nu小鼠輸注清除了CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞亞群的CD4+細(xì)胞會引起器官特異性自身免疫性疾病的發(fā)生；而同時輸注CD4+CD25+細(xì)胞可以避免這種自身免疫性疾病的發(fā)生2,。這一發(fā)現(xiàn),，為當(dāng)時調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究提供了一個可靠的表面標(biāo)志。近十年,，隨著對CD25,、CTLA-4和TGF-β這些與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞鑒別和功能密切相關(guān)的分子研究的深入3,4，人們開始關(guān)注調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持機體免疫耐受狀態(tài),，防止自身免疫病的發(fā)生,，抗移植物排斥以及腫瘤免疫中的重要作用2,19。
然而,，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記一直是爭論的焦點之一,，因為部分CD4+CD25-T細(xì)胞也具有免疫抑制功能5，同時CD25和CTLA-4也是細(xì)胞活化的標(biāo)記,，并非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所獨有的表面標(biāo)志,。

調(diào)節(jié)T的生物學(xué)特性
近期有研究表明， Foxp3基因編碼的產(chǎn)物可能對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生長以及功能發(fā)揮起重要作用6,7,8,。而且,，F(xiàn)oxp3并非細(xì)胞活化的表面標(biāo)記，而是具有免疫抑制功能的細(xì)胞所共有的標(biāo)記,。

1.Foxp3研究簡史
Foxp3基因的編碼產(chǎn)物為一個48-kDa的蛋白質(zhì)scurfin,，其特征性結(jié)構(gòu)為蛋白C端的叉頭螺旋（forkhead/winged helix）結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蛋白質(zhì)屬于DNA結(jié)合因子家族成員之一,。除了叉頭區(qū),，scurfin還包括一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)以及亮氨酸拉鏈序列，但是沒有磷酸化的PKB/AKT位點13,。scurfin屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子,，主要作用是抑制轉(zhuǎn)錄，主要表達于淋巴組織的CD4+T細(xì)胞,，但在CD8+細(xì)胞和B細(xì)胞則基本上不表達17,。體外實驗表明，scurfin以IL-2依賴的受體作為轉(zhuǎn)錄阻遏物,，但是體內(nèi)確切的靶點仍不清楚,。
在scurfy（sf）缺陷的突變小鼠內(nèi)可以觀察到CD4+T細(xì)胞相關(guān)淋巴細(xì)胞增生病,這種疾病是由于Foxp3的編碼產(chǎn)物scurfin功能缺失造成的，其表現(xiàn)與缺乏CTLA-4以及TGF-β的小鼠相似18,。
2001年,，Wildin 和Bennett 同時提出人類Foxp3基因與sf突變小鼠的Foxp3基因具有同源性9,10，該基因突變引起免疫失調(diào)性基因疾病、多發(fā)性內(nèi)分泌腺體病,、小腸免疫性疾病,、X－相關(guān)綜合癥（IPEX；也稱為X－相關(guān)自身免疫性變應(yīng)性失調(diào)綜合癥,，XLAAD）等,，這些疾病的一個共同特征就是整體免疫失調(diào)。
隨后,，Roli K等發(fā)現(xiàn),，scurfin高表達的小鼠免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)11。將Foxp3基因?qū)胄∈蠛蟀l(fā)現(xiàn),，T細(xì)胞數(shù)量明顯減少,，低于正常水平,，并且這些T細(xì)胞的增殖能力和溶細(xì)胞能力均較低,，在TCR的刺激下分泌的IL-2水平降低。雖然這類小鼠的胸腺發(fā)育正常,，但是其外周免疫器官,，尤其是淋巴結(jié)，表現(xiàn)出無細(xì)胞狀態(tài),。這說明Foxp3影響了小鼠外周免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能狀態(tài),。 2003年，Hori S等幾乎同時發(fā)現(xiàn)6,7,8,，F(xiàn)oxp3和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能相關(guān),。因此，O'Garra A將Foxp3稱為"21世紀(jì)的Foxp3",。12

2. Foxp3與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的關(guān)系
2.1 scurfin在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性表達
Fontenot使用PCR技術(shù)和western blot技術(shù),，分別證實了Foxp3mRNA和scurfin蛋白在正常小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+T細(xì)胞比CD4+CD25-T細(xì)胞高。從而考慮Foxp3在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達具有特異性,。
通過向患有淋巴細(xì)胞減少癥的小鼠體內(nèi)輸入轉(zhuǎn)導(dǎo)了Foxp3的CD4+CD25-T細(xì)胞發(fā)現(xiàn),，這些細(xì)胞不但沒有誘導(dǎo)出消耗性疾病，反而抑制了供者CD8分子的增殖,，進一步證實了Fxop3在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞獲得其調(diào)節(jié)功能的過程中起重要作用,。隨后從受者體內(nèi)分離這些表達scurfin的細(xì)胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)它們高表達IL-10mRNA,，這與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特性相同,。Hori等證實6，轉(zhuǎn)導(dǎo)了Foxp3的 CD4+CD25-T細(xì)胞同樣可以抑制淋巴細(xì)胞增生小鼠的炎性腸?。↖BD）以及胃炎的發(fā)生,，且在體外可以抑制初始T細(xì)胞增殖。然而，在這個實驗中,，即使在導(dǎo)入受者小鼠體內(nèi)之前給Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以抗CD3的刺激,， 分泌的IL-10也很低。這說明Tr細(xì)胞高IL-10mRNA表達的機制非常復(fù)雜,，或者這是只在體內(nèi)才具有的特征,。
然而，有研究表明使用TCR和CD28的抗體刺激不能誘導(dǎo)出小鼠CD4+CD25+T和CD4+CD25-的Foxp3mRNA產(chǎn)生,，說明它并非細(xì)胞活化的標(biāo)志,。這就將scurfin從其他可能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表面標(biāo)志如CD25，GITR分開,，因為那些標(biāo)志也在活化細(xì)胞表面表達,。

2.2 Foxp3和scurfin對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的作用
Roli K等的研究指出，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD4+T細(xì)胞中均有一個細(xì)胞亞群表達CD25分子的同時大量表達CD69,，但是正常小鼠的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞僅表達CD25而不高表達CD69分子,。在體外培養(yǎng)中，scurfy小鼠和Foxp3缺失小鼠的CD25+細(xì)胞在刺激下均能增殖,，且不具有調(diào)節(jié)活性,。因此上述兩種小鼠體內(nèi)T細(xì)胞 CD25的表達是伴隨著淋巴細(xì)胞增生失調(diào)的細(xì)胞活化的結(jié)果，并非一個調(diào)節(jié)性亞群細(xì)胞的標(biāo)志,。此外,，Rudensky等發(fā)現(xiàn)向新生的scurfy小鼠輸入CD4+CD25+T細(xì)胞可以預(yù)防這種淋巴細(xì)胞增生失調(diào)的發(fā)生，說明由Foxp3缺失導(dǎo)致CD4+CD25+T細(xì)胞的不足是引起淋巴細(xì)胞增生失調(diào)的關(guān)鍵,。
Foxp3的mRNA表達和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)性說明了兩者在功能上有一定關(guān)聯(lián),。缺乏功能性Foxp3基因的小鼠和人都會發(fā)生自身免疫性疾病，說明Foxp3在控制T細(xì)胞活化中起到重要作用,。為了直接證實這一點,，許多實驗組都使非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達Foxp3，隨后檢測它們的表型及功能,。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Foxp3或者在轉(zhuǎn)基因動物模型中高表達scurfin,，其結(jié)果均顯示在體外獲得了表面不具有CD25分子但是具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的細(xì)胞，其中包括CD8＋細(xì)胞,。但是這些細(xì)胞的抑制能力與Foxp3的數(shù)量并不成正比,，說明Foxp3在細(xì)胞獲得抑制作用的過程中起了重要作用，但是細(xì)胞僅有Foxp3不足以表現(xiàn)出其抑制功能,。
Devorah等使用轉(zhuǎn)基因高表達scurfin的小鼠模型（Foxp3 Tg小鼠）研究15,，發(fā)現(xiàn)其成熟性、功能性T細(xì)胞數(shù)目較正常小鼠低,。使用T細(xì)胞依賴抗原免疫的這類小鼠的血清里抗原特異性Ig數(shù)目減少,，脾臟結(jié)構(gòu)混亂。而在體外培養(yǎng)實驗中，B細(xì)胞的應(yīng)答正常,，說明該類小鼠抗體低應(yīng)答緣自體內(nèi)T細(xì)胞輔助功能缺陷,。而這類小鼠的CD4+T細(xì)胞CD40配體數(shù)目下調(diào)，分泌IFN－γ數(shù)量也減少,。這說明高表達scurfin的小鼠體內(nèi)的CD4+T不能提供輔助B細(xì)胞對T細(xì)胞依賴抗原應(yīng)答的信號,。

2.3 Foxp3和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成關(guān)系
非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達Foxp3后也能抑制體內(nèi)的自身免疫疾病發(fā)生。Foxp3相關(guān)細(xì)胞的一個重要特征是組成性表達CD25和GITR,，這與天然調(diào)節(jié)性CD4+CD25+T細(xì)胞相同,。在Fontenot等構(gòu)建的混合骨髓嵌合體模型中，即有Foxp3＋細(xì)胞,，也有Foxp3null細(xì)胞,，這說明所有的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞都是源自Foxp3基因。因此,，F(xiàn)oxp3可以調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成,。
由于表達Foxp3的CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞均可以抑制體外TCR刺激下的T細(xì)胞活化和擴增4,5,6，人們考慮了兩種可能的CD4+CD25+T細(xì)胞發(fā)源途徑：①在TCR刺激下,，初始T細(xì)胞可以分化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,，這一途徑可能類似于轉(zhuǎn)導(dǎo)因子T-bet和GATA-3誘導(dǎo)初始細(xì)胞分化為Th1，Th2,；②胸腺產(chǎn)生的一部分功能成熟的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞為CD4+CD25-T細(xì)胞，或者胸腺來源的CD4+CD25+T細(xì)胞失表達CD25分子后,，還保留了其抑制功能14,。
Hori和Khattri的數(shù)據(jù)表明，高表達Foxp3的細(xì)胞與Foxp3陰性細(xì)胞相比,，對T細(xì)胞的刺激反應(yīng)較低,，這主要表現(xiàn)在細(xì)胞反應(yīng)性增殖以及IL-2、IL-10的產(chǎn)生上,。而在混合骨髓嵌合體模型的細(xì)胞細(xì)胞中,，卻發(fā)現(xiàn)表達Foxp3的CD4+CD25-T細(xì)胞在TCR刺激下正常增殖，且有數(shù)據(jù)表明Foxp3的表達與IL-10mRNA數(shù)目增加相關(guān),。這一T細(xì)胞功能的差異是與Foxp3表達數(shù)目相關(guān),，還是與細(xì)胞純化手段或者與體內(nèi)細(xì)胞分化相關(guān)，目前尚不清楚,。值得注意的是逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和Foxp3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在體外不能如同天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞一樣高效率的抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖,，這可能與這一群細(xì)胞的異質(zhì)性有關(guān)，因為在本實驗系統(tǒng)中無法確定所有表達Foxp3的細(xì)胞都是天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,。因此Foxp3基因的存在可以指揮細(xì)胞發(fā)育成調(diào)節(jié)性T細(xì)胞譜系,，但這些細(xì)胞的最佳功能尚需要其他的因素進行調(diào)控。
現(xiàn)在已經(jīng)證實人體內(nèi)的CD4+CD25+T細(xì)胞部分表達Foxp3，并且Foxp3+的這群細(xì)胞具有免疫抑制功能,。但與小鼠不同的是,，使用TCR和抗CD28單抗聯(lián)合刺激CD4+CD25-T細(xì)胞，生成的CD4+CD25+T細(xì)胞表達Foxp3,，這些細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制性功能16,。

3．影響scurfin生成的因素
誘導(dǎo)Foxp3基因表達的因素以及可以表達這個基因的細(xì)胞群，可以決定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成的機制,。CD4+CD25+T細(xì)胞在胸腺選擇的過程中,，F(xiàn)oxp3的mRNA可以由TCR的交互作用來直接控制Foxp3的表達。此外,，胸腺APC細(xì)胞,，如表達AIRE的胸腺髓質(zhì)上皮細(xì)胞就可能跟CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成有關(guān)。但調(diào)節(jié)性T細(xì)胞內(nèi)的Foxp3+亞群是否也有在外周生成途徑,，以及哪些因素可控制這一過程,，目前仍不清楚。在胸腺發(fā)育過程中這一基因的表達產(chǎn)物不足以抑制其他Foxp3null動物的疾病,。這說明對于維系調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能,，F(xiàn)oxp3在外周的繼發(fā)表達也很重要。
盡管Foxp3對于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性的作用令人關(guān)注,，但這是否是Foxp3編碼產(chǎn)物scurfin的唯一功能尚不清楚,。高表達Foxp3的CD4+T細(xì)胞對于刺激有高反應(yīng)性，且在分泌細(xì)胞因子上有缺陷,，這說明了它們在免疫抑制作用上并非最佳,。此外在轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)，F(xiàn)oxp3mRNA的數(shù)目與外周的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目直接相關(guān),。這說明了調(diào)節(jié)性T（Foxp3+）細(xì)胞擴增能力受到自穩(wěn)狀態(tài)的限制,，或者說明Foxp3編碼產(chǎn)物對T細(xì)胞擴增發(fā)揮直接作用。因為Foxp3null和CTLA-4null小鼠表現(xiàn)出非常相似的表型,，轉(zhuǎn)基因表達的Foxp3盡管并不能完全抑制疾病發(fā)生,，但可以延遲CTLA－4null小鼠的致死性變化。這些CTLA－4null/Foxp3轉(zhuǎn)基因小鼠的Tr細(xì)胞可以延遲疾病,，說明CTLA-4信號和Foxp3信號也有一定聯(lián)系,。

4.小結(jié)
Foxp3和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)生、功能間的聯(lián)系為我們在分子水平研究機體內(nèi)這一特殊細(xì)胞群提供了依據(jù),，而Foxp3基因的表達產(chǎn)物在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面的表達,，則為我們研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，提供了一個可能的特異性標(biāo)記,。Foxp3與介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一系列細(xì)胞因子,，如CTLA-4,、GITR、IL-10和TGF-β等的功能作用有著千絲萬縷的聯(lián)系,。轉(zhuǎn)Foxp3基因進入細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞,，則為我們把調(diào)節(jié)性細(xì)胞用于臨床免疫治療提供了一種可能。但是Foxp3基因在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的中樞,、外周發(fā)育途徑中究竟起了什么作用,，它是如何參與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能發(fā)揮，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)Foxp3的基因是否能作為治療自身免疫病的發(fā)生和抗移植物排斥,、抗腫瘤免疫逃避的一條新途徑,，還有待進一步研究。

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