王輝 張文
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,，河南新鄉(xiāng),，453003）
關(guān)鍵詞：RNA干預(yù),，RNA 沉默,，免疫系統(tǒng)，基因
我們知道,，人和脊椎動(dòng)物體內(nèi)都存在著一種對(duì)抗外來病原微生物的系統(tǒng),，稱之為免疫系統(tǒng)。人們?cè)诤茉绲臅r(shí)候就對(duì)機(jī)體的免疫功能有所認(rèn)識(shí),。十八世紀(jì)末,，英國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)生Edward Jenner 從擠奶女工那里獲知，感染過毒性低的牛痘病毒就不會(huì)被天花病毒感染,，于是他發(fā)明了牛痘疫苗,，人類經(jīng)過200年的努力，終于在1980年世界衛(wèi)生組織宣布：天花從地球消失,，這是人類用人工免疫的方法,，徹底戰(zhàn)勝的第一種疾病，也為我們利用免疫學(xué)的手段征服其它疾病樹立了信心,。談到免疫,，只是指動(dòng)物體內(nèi)存在的一個(gè)防御系統(tǒng)，那么植物是否具有對(duì)抗病原微生物的能力,？人們一直對(duì)此并不太清楚,，直到最近幾年人們才發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞可以通過降解病毒RNA 的方式來對(duì)抗病毒的入侵,，稱為RNA干預(yù)（RNAi）,，并且發(fā)現(xiàn)在真菌和動(dòng)物體內(nèi)都存在這種機(jī)制。既然這種RNA干預(yù)與機(jī)體對(duì)抗病原微生物有關(guān)，它與我們已知的免疫系統(tǒng)有什么關(guān)系,？它的應(yīng)用前景如何,？
RNA干預(yù)的發(fā)現(xiàn).
十多年前，Jorgensen和他的同事們?cè)噲D加深矮牽?；ǖ淖仙?，就將一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的色素基因轉(zhuǎn)入，但結(jié)果非常驚奇,，許多花并不是紫色而是雜色,，甚至是白色。Jorgensen稱這種現(xiàn)象為共抑制（cosuppression）,，即轉(zhuǎn)入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制-出現(xiàn)基因沉默（silencing） ,，后來發(fā)現(xiàn)許多植物都有這種現(xiàn)象。盡管在一些植物中轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的沉默是由于基因特異性的甲基化的結(jié)果,，但另一些是在轉(zhuǎn)錄后水平出現(xiàn)的,，即轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）[1]。除轉(zhuǎn)基因能誘導(dǎo)PTGS外,，轉(zhuǎn)入某些病毒同樣能夠誘導(dǎo),，提示外源基因誘導(dǎo)的RNA沉默是植物對(duì)抗病毒和轉(zhuǎn)座子的一個(gè)防御系統(tǒng)。1995年,，Guo等想利用反義RNA技術(shù)阻斷線蟲（C. elegans）中的par-1基因,，但卻得到了一個(gè)意想不到的結(jié)果。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng),。但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑,。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反的。直到1998年Fire等首次揭開這個(gè)懸疑之謎,。他們證實(shí)，Guo等遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象,，以及過去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷,，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn),，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱,，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá),，他們將這一現(xiàn)象稱為RNA干預(yù)（RNA interference ,簡(jiǎn)稱RNAi）,。
RNA干預(yù)的原理
體外實(shí)驗(yàn)表明：RNAi反應(yīng)中，加入的dsRNA被切割為21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)的RNA片段,，后者會(huì)使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的片段,。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細(xì)胞中，Hammond等人部分純化了一種核酸酶-Dicer，該核酸酶具有序列特異性,，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA,。當(dāng)dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞后，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別,，切割成21-23核苷酸長(zhǎng)的小片段,，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并且作為模板識(shí)別目的mRNA,；識(shí)別之后,，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替,，從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來,，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對(duì)mRNA進(jìn)行切割,，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長(zhǎng)的dsRNA小片段,，與核酸酶形成復(fù)合物，繼續(xù)對(duì)目的mRNA進(jìn)行切割,，從而使目的基因沉默,，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象，其基本過程如圖1所示,。通過遺傳分析的方法,，目前已從線蟲中已分離到RDE-2，RDE-3和Mut-7等RNAi相關(guān)的基因,。
在線蟲中,，小量的dsRNA 能夠使大量的靶RNA沉默。 這種現(xiàn)象至少有三種機(jī)制[2]：1,、Dicer酶將長(zhǎng)dsRNA分子切成短的"初級(jí)"短RNA（siRNA）,。2、siRNA在酶作用中,，可多次應(yīng)用,，能提供進(jìn)一步放大。3,、 短RNAs可作為靶mRNA的引物,，產(chǎn)生后代"次級(jí)siRNAs"（靶序列直接擴(kuò)增），并且這樣啟動(dòng)一個(gè)RNA誘導(dǎo)的RNA聚合反應(yīng),。
RNAi與免疫作用的比較
脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)對(duì)于病毒等病原微生物的入侵采用兩步戰(zhàn)略：通過基因重排,，使有限的基因片段組成很多抗體編碼基因 ，各種抗體編碼基因分布在大量細(xì)胞之中,。 感染以后,，通過克隆選擇和相應(yīng)細(xì)胞的擴(kuò)增,， 產(chǎn)生針對(duì)免疫原的特異性免疫應(yīng)答。脊椎動(dòng)物的免疫細(xì)胞-T,、B淋巴細(xì)胞,，在早期發(fā)育階段通過陽性和陰性選擇，將能識(shí)別自身抗原的克隆排除,，從而解決了特異性的問題,。RNAi系統(tǒng)的作用也具有同樣的特異性，當(dāng)病毒進(jìn)入,，只出現(xiàn)病毒基因的沉默現(xiàn)象,，而機(jī)體的其它基因表達(dá)正常。
脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng),，能將局部接觸的抗原的信息傳播到全身,。RNAi系統(tǒng)是否具有這種功能？在植物中,，可以觀察到,，轉(zhuǎn)錄后基因沉默和病毒誘導(dǎo)的基因沉默是針對(duì)頻繁出現(xiàn)的病毒感染的保護(hù)機(jī)制。這種防御系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是其防御信號(hào)可以擴(kuò)散,，如果接種到一片樹葉的一個(gè)區(qū)域,，能將免疫力給予周圍的細(xì)胞。在線蟲中,，RNAi的最明顯的特征之一是它的全身效應(yīng),，在動(dòng)物的一個(gè)部位注射裸dsRNA可以影響其他部位基因的表達(dá)，并且dsRNA和食物一起給予通過腸腔吸收,，在性腺中發(fā)現(xiàn)影響子代基因的表達(dá),。這種能力可以增加保護(hù)作用以防被病毒重復(fù)感染 。
當(dāng)病原微生物進(jìn)入機(jī)體后,，通過抗原處理和遞呈,，使相應(yīng)淋巴細(xì)胞克隆活化，并發(fā)生克隆擴(kuò)增,，從而形成很多針對(duì)該抗原的淋巴細(xì)胞,，從而有效地對(duì)抗病原微生物。在線蟲中,，小量的dsRNA 能夠使大量的靶RNA沉默[3]。 這種現(xiàn)象主要是因?yàn)镈icer酶將長(zhǎng)dsRNA分子切成短RNA（siRNA）,， 因?yàn)槊恳粋€(gè)siRNA具有結(jié)合一個(gè)同源mRNA的能力,，效應(yīng)的放大水平取決于dsRNA的長(zhǎng)度 ，很容易檢測(cè)到放大10~20倍,。
免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要生理功能是清除體內(nèi)衰老的或異常的細(xì)胞,，從而保持機(jī)體的生理平衡和穩(wěn)定。RNAi同樣具有降解體內(nèi)異常基因的RNA的功能,，從而使異?；虿荒鼙磉_(dá)。
從上面幾方面的比較可以看出,，RNAi系統(tǒng)確實(shí)具有免疫系統(tǒng)的一些特點(diǎn),。
RNAi系統(tǒng)應(yīng)該歸為免疫系統(tǒng)
當(dāng)然，RNAi的研究才剛剛開始4年左右,，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中RNAi的研究?jī)H1年,，還有許多問題不清楚，例如它是如何識(shí)別外來基因的,？這個(gè)系統(tǒng)中還有哪些成員,？盡管如此，從已經(jīng)獲得的研究成果來看,，RNAi應(yīng)該是機(jī)體基因組水平的免疫,。如果將RNAi歸為免疫系統(tǒng)，那么我們教科書上的很多概念可能就要更改,，例如傳統(tǒng)的免疫學(xué),，免疫系統(tǒng)的組成主要指淋巴系統(tǒng)極其產(chǎn)物，免疫應(yīng)答也主要圍繞T,、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫,。既然RNAi也是機(jī)體免疫系統(tǒng)的一部分，也許應(yīng)該從體液,、細(xì)胞和基因三個(gè)水平來闡明機(jī)體對(duì)抗病毒的入侵,，也許體液、細(xì)胞免疫和RNAi之間還有某種聯(lián)系,，例如當(dāng)病毒進(jìn)入機(jī)體,，當(dāng)病毒的抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細(xì)胞時(shí)，是否其傳入的信號(hào)也啟動(dòng)了RNAi系統(tǒng),？
RNAi的在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景
目前,，人類在對(duì)待細(xì)菌感染性疾病要比病毒感染的疾病有更多的對(duì)策，其根本原因是病毒的簡(jiǎn)單性,，沒有很多的靶目標(biāo)和有些病毒的易變性,，象流感病毒和艾滋病病毒，它們的抗原經(jīng)常發(fā)生改變,，使我們很難對(duì)其通過疫苗進(jìn)行預(yù)防,。艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)將近20年，到目前為止,，還沒有有效的疫苗進(jìn)行預(yù)防,。2002年6月份《自然醫(yī)學(xué)》雜志,，刊登了美國(guó)的科學(xué)家用短干預(yù)RNA（siRNA）的方法，使細(xì)胞表面HIV病毒結(jié)合受體-CD4的基因沉默,，結(jié)果降低了細(xì)胞內(nèi)病毒的拷貝數(shù),，這的確給我們最后征服艾滋病帶來希望。除此之外,，也許我們根據(jù)HIV的mRNA的序列,，制備出雙鏈RNA（dsRNA）作為HIV的疫苗，當(dāng)它們進(jìn)入細(xì)胞后可以降解HIV的mRNA,，從而阻止HIV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,。另外，癌癥的治療同樣可以用RNAi的方法,，我們知道,，癌癥細(xì)胞之所以能無限增殖，主要與細(xì)胞內(nèi)某些基因的異常表達(dá)有關(guān),，如果我們通過RNAi的手段使這些基因沉默,，也許會(huì)取得很好的效果。
總之,，RNAi的發(fā)現(xiàn),，為我們了解生命和征服疾病提供了新的手段，同時(shí)也使我們對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)有一個(gè)更加完整的認(rèn)識(shí),。
參考文獻(xiàn)：
1． Jorgensen RA,，Cluster PD，English J et al . Plant Mol Biol. 1996,；31：957-973,。
2． Plasterk, RA. Science. 2002; 296:1263-1265.
3． Hannon. Nature. 2002; 418:244-251
本文刊登在2002年10月《醫(yī)學(xué)與哲學(xué)》雜志上
