王輝 張文
(新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫學教研室,，河南新鄉(xiāng)，453003）
關鍵詞：RNA干預,，RNA 沉默,，免疫系統(tǒng)，基因
我們知道,，人和脊椎動物體內(nèi)都存在著一種對抗外來病原微生物的系統(tǒng),，稱之為免疫系統(tǒng),。人們在很早的時候就對機體的免疫功能有所認識,。十八世紀末，英國鄉(xiāng)村醫(yī)生Edward Jenner 從擠奶女工那里獲知,，感染過毒性低的牛痘病毒就不會被天花病毒感染,，于是他發(fā)明了牛痘疫苗，人類經(jīng)過200年的努力,，終于在1980年世界衛(wèi)生組織宣布：天花從地球消失,，這是人類用人工免疫的方法，徹底戰(zhàn)勝的第一種疾病,，也為我們利用免疫學的手段征服其它疾病樹立了信心,。談到免疫，只是指動物體內(nèi)存在的一個防御系統(tǒng),，那么植物是否具有對抗病原微生物的能力,？人們一直對此并不太清楚，直到最近幾年人們才發(fā)現(xiàn),，植物細胞可以通過降解病毒RNA 的方式來對抗病毒的入侵,，稱為RNA干預（RNAi），并且發(fā)現(xiàn)在真菌和動物體內(nèi)都存在這種機制,。既然這種RNA干預與機體對抗病原微生物有關,，它與我們已知的免疫系統(tǒng)有什么關系？它的應用前景如何,？
RNA干預的發(fā)現(xiàn).
十多年前,，Jorgensen和他的同事們試圖加深矮牽牛花的紫色,，就將一個強啟動子控制下的色素基因轉入,，但結果非常驚奇，許多花并不是紫色而是雜色,，甚至是白色,。Jorgensen稱這種現(xiàn)象為共抑制（cosuppression），即轉入的外源基因和其本身的同源基因都被抑制-出現(xiàn)基因沉默（silencing） ,，后來發(fā)現(xiàn)許多植物都有這種現(xiàn)象,。盡管在一些植物中轉基因誘導的沉默是由于基因特異性的甲基化的結果,，但另一些是在轉錄后水平出現(xiàn)的，即轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）[1],。除轉基因能誘導PTGS外,，轉入某些病毒同樣能夠誘導，提示外源基因誘導的RNA沉默是植物對抗病毒和轉座子的一個防御系統(tǒng),。1995年,，Guo等想利用反義RNA技術阻斷線蟲（C. elegans）中的par-1基因，但卻得到了一個意想不到的結果,。在對照實驗中給線蟲注射正義RNA（sense RNA）以期觀察到基因表達的增強,。但得到的結果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術的解釋正好相反的,。直到1998年Fire等首次揭開這個懸疑之謎,。他們證實，Guo等遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象,，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷,，都是由于體外轉錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當他們將體外轉錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn),，基因抑制效應變得十分微弱,，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達,，他們將這一現(xiàn)象稱為RNA干預（RNA interference ,簡稱RNAi）,。
RNA干預的原理
體外實驗表明：RNAi反應中，加入的dsRNA被切割為21-23個核苷酸長的RNA片段,，后者會使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長的片段,。從已經(jīng)發(fā)生RNAi的果蠅S2細胞中，Hammond等人部分純化了一種核酸酶-Dicer,，該核酸酶具有序列特異性,，它僅降解與引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。當dsRNA導入細胞后,，被一種dsRNA特異的核酸內(nèi)切酶Dicer識別,，切割成21-23核苷酸長的小片段，這些片段可與該核酸酶的dsRNA結合結構域結合,，并且作為模板識別目的mRNA,；識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈互換,，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替,，從酶-dsRNA復合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進行切割,，這樣又產(chǎn)生了21-23核苷酸長的dsRNA小片段,，與核酸酶形成復合物，繼續(xù)對目的mRNA進行切割,，從而使目的基因沉默,，產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象，其基本過程如圖1所示,。通過遺傳分析的方法,，目前已從線蟲中已分離到RDE-2，RDE-3和Mut-7等RNAi相關的基因,。
在線蟲中,，小量的dsRNA 能夠使大量的靶RNA沉默。 這種現(xiàn)象至少有三種機制[2]：1,、Dicer酶將長dsRNA分子切成短的"初級"短RNA（siRNA）,。2,、siRNA在酶作用中,，可多次應用，能提供進一步放大,。3,、 短RNAs可作為靶mRNA的引物，產(chǎn)生后代"次級siRNAs"（靶序列直接擴增）,，并且這樣啟動一個RNA誘導的RNA聚合反應,。
RNAi與免疫作用的比較
脊椎動物的免疫系統(tǒng)對于病毒等病原微生物的入侵采用兩步戰(zhàn)略：通過基因重排，使有限的基因片段組成很多抗體編碼基因 ,，各種抗體編碼基因分布在大量細胞之中,。 感染以后，通過克隆選擇和相應細胞的擴增,， 產(chǎn)生針對免疫原的特異性免疫應答,。脊椎動物的免疫細胞-T、B淋巴細胞,，在早期發(fā)育階段通過陽性和陰性選擇,，將能識別自身抗原的克隆排除，從而解決了特異性的問題,。RNAi系統(tǒng)的作用也具有同樣的特異性,，當病毒進入，只出現(xiàn)病毒基因的沉默現(xiàn)象,，而機體的其它基因表達正常,。
脊椎動物的免疫系統(tǒng)，能將局部接觸的抗原的信息傳播到全身。RNAi系統(tǒng)是否具有這種功能,？在植物中,，可以觀察到，轉錄后基因沉默和病毒誘導的基因沉默是針對頻繁出現(xiàn)的病毒感染的保護機制,。這種防御系統(tǒng)的優(yōu)勢是其防御信號可以擴散,，如果接種到一片樹葉的一個區(qū)域，能將免疫力給予周圍的細胞,。在線蟲中,，RNAi的最明顯的特征之一是它的全身效應，在動物的一個部位注射裸dsRNA可以影響其他部位基因的表達,，并且dsRNA和食物一起給予通過腸腔吸收,，在性腺中發(fā)現(xiàn)影響子代基因的表達。這種能力可以增加保護作用以防被病毒重復感染 ,。
當病原微生物進入機體后,，通過抗原處理和遞呈，使相應淋巴細胞克隆活化,，并發(fā)生克隆擴增,，從而形成很多針對該抗原的淋巴細胞，從而有效地對抗病原微生物,。在線蟲中,，小量的dsRNA 能夠使大量的靶RNA沉默[3]。 這種現(xiàn)象主要是因為Dicer酶將長dsRNA分子切成短RNA（siRNA）,， 因為每一個siRNA具有結合一個同源mRNA的能力,，效應的放大水平取決于dsRNA的長度 ，很容易檢測到放大10~20倍,。
免疫系統(tǒng)的一個重要生理功能是清除體內(nèi)衰老的或異常的細胞,，從而保持機體的生理平衡和穩(wěn)定。RNAi同樣具有降解體內(nèi)異?；虻腞NA的功能,，從而使異常基因不能表達,。
從上面幾方面的比較可以看出,，RNAi系統(tǒng)確實具有免疫系統(tǒng)的一些特點。
RNAi系統(tǒng)應該歸為免疫系統(tǒng)
當然,，RNAi的研究才剛剛開始4年左右,，對哺乳動物細胞中RNAi的研究僅1年，還有許多問題不清楚,，例如它是如何識別外來基因的,？這個系統(tǒng)中還有哪些成員,？盡管如此，從已經(jīng)獲得的研究成果來看,，RNAi應該是機體基因組水平的免疫,。如果將RNAi歸為免疫系統(tǒng)，那么我們教科書上的很多概念可能就要更改,，例如傳統(tǒng)的免疫學,，免疫系統(tǒng)的組成主要指淋巴系統(tǒng)極其產(chǎn)物，免疫應答也主要圍繞T,、B淋巴細胞介導的細胞和體液免疫,。既然RNAi也是機體免疫系統(tǒng)的一部分，也許應該從體液,、細胞和基因三個水平來闡明機體對抗病毒的入侵,，也許體液、細胞免疫和RNAi之間還有某種聯(lián)系,，例如當病毒進入機體,，當病毒的抗原刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體和致敏淋巴細胞時，是否其傳入的信號也啟動了RNAi系統(tǒng),？
RNAi的在醫(yī)學上的應用前景
目前,，人類在對待細菌感染性疾病要比病毒感染的疾病有更多的對策，其根本原因是病毒的簡單性,，沒有很多的靶目標和有些病毒的易變性,，象流感病毒和艾滋病病毒，它們的抗原經(jīng)常發(fā)生改變,，使我們很難對其通過疫苗進行預防。艾滋病病毒發(fā)現(xiàn)將近20年,，到目前為止,，還沒有有效的疫苗進行預防。2002年6月份《自然醫(yī)學》雜志,，刊登了美國的科學家用短干預RNA（siRNA）的方法,，使細胞表面HIV病毒結合受體-CD4的基因沉默，結果降低了細胞內(nèi)病毒的拷貝數(shù),，這的確給我們最后征服艾滋病帶來希望,。除此之外，也許我們根據(jù)HIV的mRNA的序列,，制備出雙鏈RNA（dsRNA）作為HIV的疫苗,，當它們進入細胞后可以降解HIV的mRNA，從而阻止HIV在細胞內(nèi)的復制,。另外,，癌癥的治療同樣可以用RNAi的方法,，我們知道，癌癥細胞之所以能無限增殖,，主要與細胞內(nèi)某些基因的異常表達有關,，如果我們通過RNAi的手段使這些基因沉默，也許會取得很好的效果,。
總之,，RNAi的發(fā)現(xiàn)，為我們了解生命和征服疾病提供了新的手段,，同時也使我們對機體的免疫系統(tǒng)有一個更加完整的認識,。
參考文獻：
1． Jorgensen RA，Cluster PD,，English J et al . Plant Mol Biol. 1996,；31：957-973。
2． Plasterk, RA. Science. 2002; 296:1263-1265.
3． Hannon. Nature. 2002; 418:244-251
本文刊登在2002年10月《醫(yī)學與哲學》雜志上
