張曉明綜述 焦新安審校
（揚州大學(xué),， 江蘇揚州 225009）
摘要 減毒沙門氏菌通過自然感染的方式高效地將DNA疫苗直接運送給體內(nèi)的抗原提呈細胞(APCs)如樹突細胞（DCs）和巨噬細胞,，在粘膜和全身淋巴組織誘發(fā)以Th1型應(yīng)答為主的細胞免疫和體液免疫, APCs尤其是DCs可能在其中起到了關(guān)鍵作用。減毒沙門氏菌已被應(yīng)用于運送病毒,、細菌和腫瘤DNA疫苗并取得一定效果,該途徑所誘發(fā)的細胞免疫要強于肌注途徑接種的相同DNA疫苗和減毒沙門氏菌運輸?shù)木幋a相同抗原的原核表達質(zhì)粒,。本文還對如何增強攜帶DNA疫苗的重組減毒沙門氏菌的免疫效果作了探討。
關(guān)鍵詞 減毒沙門氏菌; DNA疫苗; 樹突細胞; 巨噬細胞; 免疫應(yīng)答
在過去的十年中,，DNA疫苗得到迅速的發(fā)展,。DNA疫苗可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫,它具有制備相對簡單,運輸保存容易,可方便構(gòu)建多價疫苗和加入多種免疫佐劑分子等優(yōu)點。DNA疫苗的免疫方法主要有肌肉注射,，皮內(nèi)(包括使用基因槍法),、皮下接種。然而這些方法都存在DNA攝取效率低或需特殊設(shè)備等缺點,。采用重組減毒胞內(nèi)菌（如沙門氏菌,，志賀氏菌，李斯特菌）通過粘膜自然感染途徑運送DNA疫苗是一類很有希望的方法（1）,，這些細菌可將DNA疫苗直接呈送給APCs,，具有運送效率高,，免疫方法簡單，免疫效果好（包括載體菌本身可作為免疫佐劑）,，能同時激活粘膜免疫和全身免疫,，并可獲得對載體菌的免疫等優(yōu)點。
沙門氏菌是一類重要的人獸共患病原菌,，目前對它的研究已很詳盡, 遺傳背景清楚, 易于操作和控制, 利用它作為載體原核表達各種外源抗原已得到廣泛的研究并取得良好的免疫效果（2）,；而利用沙門氏菌作為DNA疫苗運送載體的研究方興未艾，已顯示出誘人的前景,。
1 減毒沙門氏菌的侵入途徑
在腸道沙門氏菌侵入機體的途徑可分為兩種：以M細胞為代表的上皮細胞途徑和非上皮細胞途徑,。具有侵襲力的沙門氏菌可選擇性地侵入派伊爾結(jié)(PP)的M細胞并破壞M細胞(2),然后可被位于上皮下穹隆區(qū)（SED）的APCs捕獲。DCs被認為是早期吞噬沙門氏菌的主要細胞,因為在SED巨噬細胞缺乏,而DCs卻大量存在（2）,。Hopkins等（3）發(fā)現(xiàn)小鼠口服減毒沙門氏菌PhoPc株后最早被PP的DCs吞噬并能在其中存活一段時間,。
沙門氏菌還可通過吞噬細胞直接吞噬的非上皮細胞途徑侵入機體。Vazquez-Torres等（4）發(fā)現(xiàn)CD18+ 吞噬細胞在腸道直接吞噬缺乏侵襲力的沙門氏菌并將其運送至脾臟,，Rescigno等（5）進一步證明了DCs可打開腸道上皮間的緊密連接直接進入腸腔吞噬沙門氏菌,，同時DCs能分泌緊密連接蛋白，保證了腸上皮細胞屏障的完整性,。缺乏侵襲力的沙門氏菌在口服后15分鐘就出現(xiàn)在血液中,30分鐘達到高峰（4）,， 小鼠血清中可產(chǎn)生針對沙門氏菌的抗體反應(yīng)，但不能在腸道粘膜誘生抗體反應(yīng)（4）,，這說明沙門氏菌侵入的非上皮細胞途徑與上皮細胞途徑是相互獨立的,。
突破腸道屏障重組沙門氏菌被吞噬細胞吞噬后，被運送至相關(guān)粘膜和全身淋
巴組織（2）,。Paglia等(6)發(fā)現(xiàn)小鼠口服攜帶綠色熒光蛋白（GFP）真核表達質(zhì)粒的
重組沙門氏菌后, GFP可在脾臟的 DCs和巨噬細胞中表達,。Flo等(7)作了更為精細的實驗，他們將GFP真核表達質(zhì)粒的GFP基因內(nèi)插入人類α球蛋白內(nèi)含子,，該質(zhì)粒只有在真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并剪切去內(nèi)含子的情況下才表達產(chǎn)生熒光的GFP,。小鼠口服攜帶該質(zhì)粒的重組沙門氏菌后，GFP在脾臟,、 PP和小腸粘膜固有層的DCs和巨噬細胞中表達,。以上實驗證實了采用減毒沙門氏菌運載DNA疫苗至粘膜和全身免疫組織中特定APCs的可行性。
2 減毒沙門氏菌的胞內(nèi)定位及對DNA疫苗的呈送
沙門氏菌在進化中獲得了多種逃避宿主細胞殺傷的機制(8),沙門氏菌被宿主細胞吞噬后將停留在吞噬泡內(nèi),不能逃離進入胞液,,。不具有逃離吞噬泡功能的DNA疫苗重組沙門氏菌可誘發(fā)機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,，那么減毒沙門氏菌荷載的DNA疫苗是如何離開吞噬泡而進入胞液的呢？目前這一機制尚不明了,，在體外實驗中,不具有逃離吞噬泡功能的重組沙門氏菌可直接呈送DNA疫苗給腹腔原代巨噬細胞（9）(22)(23)和DCs（10）（34）,，而不能給巨噬細胞系細胞（9）。Rodriguez等(11)在DCs中發(fā)現(xiàn)了一種吞噬泡-胞液抗原轉(zhuǎn)運機制,目前對該類機制還不很清楚,可能存在一個或幾個相關(guān)通道(19),但這提示DCs和成熟巨噬細胞吞噬泡內(nèi)DNA疫苗的轉(zhuǎn)運可能與此相關(guān),。
有證據(jù)表明獲得逃離吞噬泡功能的重組沙門氏菌呈送DNA疫苗的效率要高于不具有逃離吞噬泡功能的重組沙門氏菌,。在體外實驗中,，Catic等(12)報道表達李斯特溶血素(Hly)-OVA DNA疫苗重組沙門氏菌促進了巨噬細胞MHC I 類途徑OVA抗原的提呈; 最近Gentschev等(13)證實分泌Hly的重組沙門氏菌可有效破壞巨噬細胞的吞噬泡膜;進一步經(jīng)口服或腹膜內(nèi)免疫小鼠,發(fā)現(xiàn)攝取DNA疫苗并表達目的抗原的腹腔巨噬細胞數(shù)量比免疫不分泌Hly的重組沙門氏菌小鼠組要高2至3倍。采用含Hly重組沙門氏菌的另一個優(yōu)點是可克服某些APCs攝取DNA疫苗的限制性,。
攜帶DNA疫苗的重組菌釋放DNA疫苗一般是在自身自然裂解后發(fā)生,一種很有希望的方法是人工誘導(dǎo)重組菌裂解,。Jian 等(14)將λ噬菌體S和R基因置于阿拉伯糖可誘導(dǎo)啟動子PBAD之下,在體外誘導(dǎo)條件下,鼠傷寒沙門氏菌裂解釋放質(zhì)粒DNA; Dietrich等(15)將李斯特菌特異的噬菌體裂解基因?qū)肜钏固鼐?在李斯特菌逃離吞噬泡進入胞液后噬菌體裂解基因表達, 李斯特菌裂解釋放DNA疫苗。
3攜帶DNA疫苗重組減毒沙門氏菌誘發(fā)機體免疫應(yīng)答的機制
重組減毒沙門氏菌攜帶的DNA疫苗如何激發(fā)機體的細胞免疫和體液免疫?目前這一機制尚不很清楚, Darji等（9）(16)設(shè)想了以下途徑: DCs和巨噬細胞吞噬侵入腸粘膜屏障的重組沙門氏菌并被激活,活化的 DCs和巨噬細胞遷移至脾臟等淋巴組織(DCs具很強的遷移能力,而巨噬細胞尚有疑問(2)),此時載體菌裂解, DNA疫苗以某種途徑進入胞液,然后進入細胞核,表達目的抗原,。接著特異的CTL被激活,，裂解表達抗原的APCs，APCs內(nèi)的抗原被釋放激活輔助T細胞和誘生抗體反應(yīng),，至此細胞免疫和體液免疫均被激活,，且載體菌的成分如LPS和DNA疫苗上的免疫刺激序列（ISS）等還可作為佐劑加強免疫應(yīng)答。另外一條運輸途徑是CD18+ 吞噬細胞（4）和DCs（5）在腸腔直接吞噬重組菌并運送至相關(guān)淋巴組織,。
另一種可能的機制是重組沙門氏菌引起吞噬它的APCs的凋亡,，凋亡產(chǎn)物（可含目的抗原/DNA疫苗）被鄰近的APCs吞噬。Yrlid等（17）在體外實驗中發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌14028可誘導(dǎo)髓源巨噬細胞凋亡,，作為"旁觀者"的巨噬細胞和DCs都可吞噬凋亡產(chǎn)物,。DCs在DNA疫苗免疫中的"交叉激活(cross-priming)"作用已得到重視（18），體內(nèi)實驗顯示小鼠CD8+ DCs是"交叉提呈(cross-presentation)"抗原的主要APCs,，在微生物刺激下,，CD8-CD4- DCs也可起"交叉提呈"作用(19)。
4 攜帶DNA疫苗重組減毒沙門氏菌的應(yīng)用
4.1 病毒疫苗
4.1.1 人類免疫缺陷病毒(HIV)疫苗
攜帶編碼HIV囊膜蛋白DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌SL7207經(jīng)胃免疫小鼠可同時在脾臟和PP誘生HIV囊膜蛋白特異的IFN-γ-分泌CD8+ T細胞,而肌內(nèi)免疫同樣的DNA疫苗只能在脾臟產(chǎn)生HIV囊膜蛋白特異的CD8+ T細胞,兩種免疫方法均不能有效誘生HIV囊膜蛋白特異的IFN-γ-分泌CD4+ T細胞(20),。與此相對應(yīng)的是,，重組鼠傷寒沙門氏菌原核表達HIV gp120-沙門氏菌外膜蛋白OmpA 融合蛋白可誘生HIV特異的sIgA和CD4+ T細胞(21),但不能產(chǎn)生HIV特異的CD8+ T細胞(20)。以上實驗首次報道了攜帶HIV DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌在粘膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了HIV特異的CD8+ T細胞,，這對于發(fā)展HIV疫苗,，防止HIV經(jīng)粘膜途徑傳播有積極意義。同時還說明單一免疫方法不能有效激活體內(nèi)的免疫通路,，將攜帶HIV原核表達質(zhì)粒和真核表達質(zhì)粒的重組沙門氏菌結(jié)合起來可能會產(chǎn)生更好的效果,。
4.1.2 乙型肝炎病毒(HBV) 疫苗
Woo等(22)用攜帶HBsAg DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌SL7207口服免疫小鼠,并與肌注DNA疫苗和腹膜下免疫重組HBsAg的免疫方法進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服重組沙門氏菌組可誘生與肌注DNA疫苗組相當強度的CTL反應(yīng),，重組HBsAg免疫組的CTL反應(yīng)最弱；抗體反應(yīng)為重組HBsAg免疫組產(chǎn)生的HBsAg特異的IgG最高,，肌注DNA疫苗組次之,，口服重組沙門氏菌組的抗體反應(yīng)很弱。 進一步的研究（23）發(fā)現(xiàn)口服重組沙門氏菌組引發(fā)最強的Th1和CTL反應(yīng),，產(chǎn)生的很弱IgG2a抗體,；重組HBsAg免疫組引發(fā)很強的IgG1(Th2)抗體反應(yīng), Th1和CTL反應(yīng)很弱; 肌注DNA疫苗組產(chǎn)生的抗體譜和強度與重組HBsAg免疫組相當,但也可誘生中等強度的Th1和CTL反應(yīng)。以上實驗說明不同途徑的免疫方法誘發(fā)肌體產(chǎn)生不同類型的免疫應(yīng)答, 口服攜帶HBsAg DNA疫苗的重組沙門氏菌可產(chǎn)生很強的CTL反應(yīng)而抗體反應(yīng)很弱,顯示出它作為治療性疫苗的優(yōu)勢,。
作為APCs的巨噬細胞在口服重組沙門氏菌免疫中的重要作用也得到證實（23）,。小鼠腹腔巨噬細胞體外感染攜帶HBsAg DNA疫苗的重組沙門氏菌可表達HBsAg,，刺激HBsAg特異的脾細胞增殖和Th1細胞分泌IFN-γ，以及HBsAg特異的CTL反應(yīng),，提示巨噬細胞能從MHCⅠ,、Ⅱ兩類途徑提呈HBsAg，而巨噬細胞卻不能有效提呈直接外加的HBsAg,，說明沙門氏菌載體/DNA疫苗骨架還起到強免疫佐劑的作用,。靜脈或腹膜內(nèi)輸注含有重組沙門氏菌的巨噬細胞給同系未免疫小鼠可誘生與口服免疫重組沙門氏菌相類似的免疫應(yīng)答。然而,，作為最強APCs的DCs在口服重組沙門氏菌免疫應(yīng)答中的作用還需得到闡明,。
4.1.3 丙型肝炎病毒(HCV) 疫苗
小鼠口服免疫攜帶HCV-NS3 DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌可誘發(fā)HCV特異的CTL反應(yīng)（24）。體外實驗顯示,，86%小鼠產(chǎn)生了針對免疫顯性表位NS3-1073特異的IFN-γ-分泌T細胞,，并能持續(xù)10個月之久；小鼠還能產(chǎn)生表位NS3-1169特異的細胞毒和IFN-γ-分泌T細胞,，對表位NS3-1406也能產(chǎn)生特異的IFN-γ-分泌T細胞,。引發(fā)CTL的最低DNA疫苗量為2ng。用重組表達HCV-NS3的牛痘病毒攻擊小鼠,，口服重組沙門氏菌組體內(nèi)的病毒滴度大大低于口服空載體組,。
4.1.4 單純皰疹病毒(HSV) 疫苗
Flo等(7)比較了小鼠口服攜帶HSV-糖蛋白D(gD) DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌和肌注相同gD DNA疫苗效果的比較。兩組均產(chǎn)生Th1類為主的抗體反應(yīng),，肌注DNA疫苗組的抗體水平要高于口服重組菌組,，但后者IgG2a/IgG1比值較前者大。兩組均可激活脾臟HSV特異的CD4+ T細胞,，都產(chǎn)生很強的DTH反應(yīng),。經(jīng)體外滅活HSV刺激后，兩組脾臟的IFN-γ-分泌細胞均顯著增多,，但口服重組菌組要高兩倍,，而且只有口服重組菌組的PP和回腸淋巴結(jié)產(chǎn)生IFN-γ-分泌細胞。當?shù)蛣┝縃SV毒株攻毒時,，只有口服重組菌組可有效控制感染,。以上實驗說明小鼠口服重組沙門氏菌比肌注DNA疫苗更能有效地激活局部細胞免疫反應(yīng)，而細胞免疫對于預(yù)防HSV從粘膜途徑感染是相當重要的（7）,。
4.1.5. 偽狂犬病病毒(PrV)疫苗
Shiau等(25)用運載PrV糖蛋白gD DNA疫苗的重組沙門氏菌口服免疫小鼠,可誘發(fā)抗PrV抗體, PrV特異的淋巴細胞增殖和CTL反應(yīng),并能在PrV毒株攻擊下有效保護小鼠,；同時口服攜帶PrV gD真核表達質(zhì)粒和胸腺素原α真核表達質(zhì)粒重組沙門氏菌可增強上述免疫應(yīng)答，免疫一次就能使小鼠免受PrV毒株的致死攻擊,。
4.2細菌疫苗
攜帶鞭毛蛋白-突變型大腸桿菌耐熱腸毒素融合蛋白(FLA-STmt)原核表達質(zhì)粒的重組鼠傷寒沙門氏菌口服免疫小鼠不能引發(fā)小鼠對鞭毛蛋白的免疫應(yīng)答,而攜帶FLA-STmt真核表達質(zhì)粒的重組菌可誘生低滴度的抗鞭毛蛋白IgG抗體,但兩種方法均不能誘發(fā)對STmt的免疫應(yīng)答（26）,。
Pasetti等（27）發(fā)現(xiàn)攜帶表達破傷風(fēng)毒素C末端(Frag C)原核和真核表達質(zhì)粒的重組傷寒沙門氏菌鼻內(nèi)免疫小鼠均可誘生高滴度的抗Frag C IgG1, IgG2a和IgG2b且攜帶真核質(zhì)粒的重組菌產(chǎn)生的抗體滴度比攜帶原核質(zhì)粒的重組菌的要高;肌內(nèi)接種表達Frag C的真核質(zhì)粒產(chǎn)生中等滴度的抗Frag C IgG1, IgG2a和IgG2b;而肌內(nèi)直接接種Frag C則誘生高滴度的IgG1和中等滴度的IgG2a和IgG2b。與此對應(yīng)的是，體外Frag C刺激脾細胞實驗表明攜帶原核和真核質(zhì)粒的重組菌組IFN-γ顯著增高,；肌內(nèi)接種真核質(zhì)粒組IFN-γ和IL-2顯著增高,，而肌內(nèi)直接接種Frag C組則分泌高水平的IL-4、5及IL-2,、IFN-γ,。以上實驗說明攜帶原核和真核質(zhì)粒的重組傷寒沙門氏菌及肌內(nèi)接種真核質(zhì)粒同時誘導(dǎo)了小鼠的Th1和Th2反應(yīng)，而肌內(nèi)直接接種Frag C主要誘導(dǎo)了Th2反應(yīng), 攜帶真核質(zhì)粒重組菌的免疫效果要優(yōu)于攜帶原核質(zhì)粒的重組菌和肌內(nèi)接種真核質(zhì)粒,。
Darji等（9）用攜帶李斯特菌溶血素DNA疫苗的重組鼠傷寒沙門氏菌口服免疫小鼠,獲得了很強的CTL,、Th1型CD4+ T細胞和混合型抗體反應(yīng)(高水平IgG2a和IgG 1),并能保護小鼠免受致死量李斯特菌的攻擊。Darji等（16）還發(fā)現(xiàn)沙門氏菌介導(dǎo)的DNA疫苗免疫可誘生免疫記憶,，增強重組沙門氏菌的侵襲力可加強免疫效果,，另外發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)接種和經(jīng)口途徑都可誘發(fā)全身免疫，但粘膜免疫的效果不一樣：口服免疫可在腸道而不在肺產(chǎn)生抗體,；鼻內(nèi)免疫在肺而不在腸道產(chǎn)生抗體,。這可能是由于小鼠的耐受性有限，鼻內(nèi)接種的重組菌不能過多,。
4.3 腫瘤疫苗
Paglia等(6)以β半乳糖苷酶(β-gal) 作為人工腫瘤抗原,小鼠口服攜帶β-gal DNA疫苗的重組沙門氏菌可誘發(fā)產(chǎn)生Th1型細胞和體液免疫,在表達β-gal的纖維肉瘤細胞攻擊下,小鼠獲得了一定的保護力,免疫組生長腫瘤的小鼠數(shù)比對照組少且腫瘤小,前者的生存期比后者明顯延長,。Zoller等(28)也將β-gal作為人工腫瘤抗原,比較了小鼠三種免疫方法的效果。結(jié)果靜脈輸注含有β-gal的DCs抑瘤效果最好,，口服重組減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207（含β-gal DNA疫苗）次之,，肌注β-gal DNA疫苗效果最差。荷有β-gal的DCs主要激活CD4+ Th通路,，而口服重組菌主要激活CD8+ CTL通路,。將上面兩種免疫方法結(jié)合，小鼠先口服免疫重組菌,，再靜脈輸注荷有β-gal的DCs作加強免疫,，兩個通路都得到充分激活，形成優(yōu)勢互補,，效果達到最佳,，在十倍致死量腎癌細胞（RENCA-β-gal）的攻擊下有超過半數(shù)的免疫小鼠未生長腫瘤。
美國Scripps研究所作了一系列重組減毒鼠傷寒沙門氏菌運載腫瘤DNA疫苗的工作,涉及的腫瘤有黑色素瘤(29)(30),、成神經(jīng)細胞瘤(31),、腸癌(32)(34)、肺癌(33),。減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207運輸表達小鼠黑色素瘤gp10025-33和TRP-2181-188肽表位的DNA疫苗,，在該疫苗未連接泛素基因時不能誘發(fā)有效抗腫瘤T細胞免疫，但在目的基因上游泛素化以后可打破外周耐受,，激發(fā)有效的CTL反應(yīng)，說明泛素能增強機體對腫瘤抗原的處理和提呈能力(29)。在用抗神經(jīng)節(jié)苷脂 GD2- IL-2融合蛋白 (ch14.18-IL2)作加強免疫后,，免疫效果進一步增強,，8只小鼠中有6只能完全消除攻擊的腫瘤細胞，另兩只皮下的腫瘤生長也大受抑制(30),。該免疫效果的取得是與CD4+ T細胞在CD8+ T細胞殺瘤效應(yīng)階段的輔助分不開的,。本實驗說明：1，運用ch14.18-IL2將IL-2導(dǎo)向腫瘤微環(huán)境可增強抗腫瘤免疫,；2,，CD4+ T細胞的輔助對CTL效應(yīng)是相當重要的。用減毒鼠傷寒沙門氏菌運送表達酪氨酸羥化酶抗原的DNA疫苗口服免疫小鼠可保護小鼠免受成神經(jīng)細胞瘤細胞致死量的攻擊(31),。用減毒鼠傷寒沙門氏菌運輸表達癌胚抗原(CEA)的DNA疫苗可激發(fā)有效的CD8+ T細胞抗腫瘤免疫（腸癌（32）,，肺癌（33）），并可被重組抗體-IL2融合蛋白所做的加強免疫增強,。在將CD40L與CEA共表達,，再用重組抗體huKS1/4-IL-2融合蛋白作加強免疫后，100%的小鼠在受腸癌細胞攻擊后不生長腫瘤,，DCs和CTLs被有效激活（34）,。
最近，Cochlovius等（35）進行了沙門氏菌荷載表達人類黑色素瘤糖蛋白hgp100 DNA疫苗的實驗,。在體外實驗中,，該DNA疫苗可被DCs高效攝取和表達；對小鼠進行口服免疫,，3天后發(fā)現(xiàn)gp100在腸系膜淋巴結(jié)樹突樣細胞中表達,，該疫苗誘生很強的CTL應(yīng)答并能在B16-hgp100腫瘤細胞的攻擊下70%的免疫組小鼠不生長腫瘤,。免疫組小鼠的脾細胞體外經(jīng)B16-hgp100腫瘤細胞刺激后,， CD8+ T細胞和IFN-γ-分泌細胞的數(shù)量顯著增多，但CD4+ T細胞的數(shù)目沒有增多,。
5 小結(jié)與展望
盡管DNA疫苗已得到廣泛的研究,其免疫效果卻不盡如人意,一些在小鼠實驗中很有效的DNA疫苗在人體試驗的結(jié)果也令人失望,一個重要的原因是運用常規(guī)接種途徑(肌肉注射,，皮內(nèi)接種) 淋巴組織攝取的抗原量有限(36),。Maloy等(36)比較了淋巴細胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)gp33 DNA疫苗幾種免疫途徑的效果, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹股溝淋巴結(jié)直接注射DNA疫苗誘生的CTL反應(yīng)比肌肉注射和皮內(nèi)接種相同DNA疫苗高100-1000倍,在攻毒實驗中只有淋巴結(jié)注射組小鼠可抵抗表達LCMV gp33的牛痘病毒和腫瘤細胞的攻擊,。這顯示出DNA疫苗直接導(dǎo)入淋巴組織這一接種途徑的優(yōu)越性, 從理論上支持了采用重組沙門氏菌直接運送DNA疫苗至體內(nèi)APCs的方法,。
用于改進常規(guī)DNA疫苗的方法完全適用于重組沙門氏菌荷載的DNA疫苗,，如共表達胸腺素原α(25),、泛素（29）（30）,、CD40L（34）。這些分子佐劑的應(yīng)用對粘膜途徑免疫還有著特別的意義,，小鼠對重組菌的接種量有一定的限度,，因為革蘭氏陰性菌的細胞壁LPS對其有一定的毒性,，如鼻內(nèi)接種量不能大,，這就影響了免疫效果（16）,；而加入分子佐劑后增強了免疫效果并可減少接種的次數(shù),。另外通過增強沙門氏菌的侵襲力（16）或增加沙門氏菌逃離吞噬泡的功能也能提高免疫應(yīng)答的效果（12）（13）,。也有報道在口服免疫時同時服用氨芐青霉素增加DNA疫苗免疫效果的報道（37）,，這可能是抗生素增加了DNA疫苗在沙門氏菌體內(nèi)的穩(wěn)定性。
總體上看,，粘膜途徑接種荷載DNA疫苗的重組沙門氏菌主要誘生Th1型應(yīng)答和很強的CTL活性,，其免疫應(yīng)答強度要大于其它免疫方法（包括肌注相同的DNA疫苗,，原核表達的重組沙門氏菌,，接種蛋白質(zhì)抗原）,，除能激活全身免疫外還活化了粘膜免疫，這對預(yù)防粘膜途徑傳播的病原微生物,，特別是需要細胞免疫的顯得十分重要,。但不同的報道間也存在著一定的差異,，體液免疫應(yīng)答的抗體水平的差異尤為明顯,。這可能與選取的目的抗原和免疫方法的不同有關(guān)。一個重要的認識是高效CTL效應(yīng)的取得依賴于CD4+ T細胞的輔助(30), Coombes建議在設(shè)計CTL效應(yīng)為目的DNA疫苗時也需同時加入MHCⅠ類和Ⅱ類限制性表位(18),。
APCs是誘發(fā)沙門氏菌攜帶的DNA疫苗免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素,，產(chǎn)生強Th1型應(yīng)答是通過作為強Th1型佐劑的載體菌和DNA疫苗上的免疫刺激序列作用于APCs來達到的, APCs上的不同Toll樣受體(TLRs)可能在Th1型刺激性信號的接受和傳導(dǎo)方面起主導(dǎo)作用（38）（39）。巨噬細胞在HBsAg DNA疫苗的免疫應(yīng)答中起到重要作用（21）,；而DCs被認為是DNA疫苗誘發(fā)細胞免疫的主要APCs(18),DCs應(yīng)在此免疫應(yīng)答中起更重要的作用,，一些實驗也正在證實這一點(6)(7)（10）(33)(34)（35）,。DCs的功能具有可塑性,，它最終誘發(fā)免疫應(yīng)答的結(jié)果取決于自身來源（不同的亞群）和分化程度，微環(huán)境和抗原的類型等因素的綜合影響（38）（39）,，這就為我們優(yōu)化重組疫苗包括連接各種佐劑分子來控制免疫應(yīng)答的結(jié)果奠定了理論基礎(chǔ)。
粘膜免疫的一個優(yōu)點是一處免疫其它部位粘膜組織的粘膜免疫也被激活。如口服攜帶沙眼衣原體主要外膜蛋白(MOMP) DNA疫苗重組沙門氏菌可保護小鼠從呼吸道所受的沙眼衣原體攻擊(40); 口服攜帶HSV gD DNA疫苗的重組沙門氏菌的小鼠可控制HSV生殖道粘膜的感染(7),。但不同粘膜途徑的免疫也會產(chǎn)生一定的結(jié)果差異（16）,。
沙門氏菌兩種不同的侵入途徑也給我們新的提示,。缺乏侵襲力的沙門氏菌可誘生全身免疫而不產(chǎn)生粘膜免疫（4）,，這就使得我們可以通過口服免疫來完成一些不需要粘膜免疫的全身免疫,。
沙門氏菌與體內(nèi)特定APCs親和的特性還可被用作基因治療,，矯正APCs的基因缺陷,。沙門氏菌攜帶的IFN-γ真核表達質(zhì)粒可在IFN-γ基因缺失的小鼠巨噬細胞中表達, IFN-γ基因缺失的小鼠口服此重組沙門氏菌后獲得了自然抵抗細菌感染的能力（41）。
減毒沙門氏菌給我們提供了一個簡單,、高效DNA疫苗免疫的方法,，然而從目前的研究來看，單一的免疫途徑往往很難達到很令人滿意的免疫效果,，口服沙門氏菌攜帶的DNA疫苗一般不能同時有效活化體內(nèi)相關(guān)免疫通路,更強的免疫應(yīng)答需要其它免疫方法的聯(lián)合使用（28）（30）（32）（33）（34）。我們實驗室今后的研究重點將放在優(yōu)化重組減毒沙門氏菌疫苗和/或組合幾種免疫途徑以充分激活體內(nèi)免疫通路,，從而取得高效,、持久的免疫應(yīng)答。
參 考 文 獻
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*國家自然科學(xué)基金資助項目 (30170700);高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師教學(xué)科研獎勵計劃資助項目
作者簡介：張曉明(1977-),男,碩士研究生,主要從事基因疫苗免疫機理方面的研究,。
聯(lián)系地址：揚州大學(xué)80225信箱 郵編 225009 E-MAIL： [email protected]
