吳砂 綜述

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室

摘 要：樹突狀細(xì)胞是至今發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞,，人們能過(guò)各種刺激提高其抗原提呈能力和誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答能力，本文簡(jiǎn)單介紹了樹突狀細(xì)胞疫苗在宮頸癌的免疫治療方面的新進(jìn)展,。
關(guān)鍵詞：樹突狀細(xì)胞,，宮頸癌，免疫治療,，疫苗

樹突狀細(xì)胞（Dendritic cell,DC）是目前發(fā)現(xiàn)功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞的（antigen-presenting cell,APC）,雖然在體內(nèi)數(shù)目較少,，但其抗原呈遞功能遠(yuǎn)強(qiáng)于巨噬細(xì)胞，B細(xì)胞等其他抗原呈遞細(xì)胞,，具有強(qiáng)大地激活CD8＋CTL,，CD4＋T細(xì)胞的功能，并能分泌多種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié),。隨著目前體外培養(yǎng)擴(kuò)增DC的技術(shù)日益成熟,，及基因工程技術(shù)的進(jìn)展，采用DC疫苗對(duì)腫瘤進(jìn)行生物治療已成為生物治療領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn),，本文就DC細(xì)胞在宮頸癌生物治療的進(jìn)展進(jìn)行綜述,。

1.DC細(xì)胞簡(jiǎn)介：
它是細(xì)胞內(nèi)抗原加工、提呈的關(guān)鍵細(xì)胞,，在機(jī)體的抗腫瘤免疫中起十分重要的作用,。目前研究認(rèn)為其抗腫瘤的主要機(jī)制為（1）DC進(jìn)入腫瘤,捕獲抗原,將其處理后,與MHCⅡ類分子結(jié)合成MHCⅡ類分子－抗原肽復(fù)合體,表達(dá)于細(xì)胞膜表面,提呈給Ｔ細(xì)胞,為Ｔ細(xì)胞提供第一活化信號(hào)。在此過(guò)程中,DC逐漸成熟,許多粘附分子,、共刺激分子表達(dá)上調(diào),為Ｔ細(xì)胞提供第二活化信號(hào),從而促 發(fā)Ｔ細(xì)胞大量活化,、增殖、分化,產(chǎn)生特異性CＴＬ,。（2）腫瘤抗原肽可經(jīng)MHCⅠ分子途徑遞呈給CD8+Ｔ細(xì)胞,而無(wú)需CD4+Ｔ細(xì)胞輔助,直接激活誘導(dǎo)CTL反應(yīng)（3）DC能分泌IL-12,使原始Ｔ細(xì)胞生成Th1型應(yīng)答反應(yīng),。還可以分泌IL－7，促進(jìn)CD4,、CD8T細(xì)胞的增殖及B細(xì)胞的分化 (4)DC可通過(guò)吞噬凋亡的腫瘤細(xì)胞獲得抗原,從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答,。通過(guò)上述機(jī)制，DC誘發(fā)特異性的CTL,，殺傷腫瘤細(xì)胞,。

2．樹突狀細(xì)胞疫苗進(jìn)展：
2.1 宮頸癌抗原沖擊致敏
通過(guò)對(duì)宮頸癌的深入研究，已經(jīng)證實(shí)了人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus ,HPV）與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān),，尤其是其高危型-HPV16型與18型,，它的E6、E7的表達(dá)是維持腫瘤細(xì)胞處于轉(zhuǎn)化狀態(tài)所必需的,，所以可以將E6,、E7原癌蛋白視作腫瘤特異性抗原,。
由于DC細(xì)胞是最強(qiáng)的APC細(xì)胞，所以可以通過(guò)在體外用腫瘤抗原進(jìn)行沖擊強(qiáng)化致敏的方法使DC高度表達(dá)MHCⅠⅡ類分子,，,提呈豐富的腫瘤抗原肽,而共刺激分子,、粘附分子如B7-1、B7-2,、CD40等表達(dá)亦明顯上調(diào),可為Ｔ細(xì)胞的激活充分提供第一,、二活化信號(hào)，這類疫苗在體內(nèi)外均可使Ｔ細(xì)胞被有效激活,產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),。

2.1.1宮頸癌細(xì)胞懸液沖擊致敏
將帶HPV的SiHa,Caski細(xì)胞系與DC 中朗格漢期細(xì)胞共同培養(yǎng),，在培養(yǎng)過(guò)程中向其中加入800ul/ml GM-CSF與100ul/ml IL-4,發(fā)現(xiàn)LC數(shù)目明顯增多，分化更加成熟,，對(duì)CTL的呈遞作用更強(qiáng),。

2.1.2 宮頸癌HPV蛋白多肽致敏
將宮頸癌HPV所產(chǎn)生的蛋白作為抗原，預(yù)先對(duì)樹突狀細(xì)胞進(jìn)行沖擊強(qiáng)化,，是常用的方法之一,，也是比較成熟的方法。Santin AD 等在1999年用重組的,，完整的HPV16E7蛋白對(duì)自體的DC細(xì)胞進(jìn)行強(qiáng)化,，他通過(guò)將構(gòu)造的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase,GST）與E7的融合蛋白轉(zhuǎn)入E.coli BL21來(lái)大量生產(chǎn)E7蛋白，再通過(guò)脂質(zhì)體法將E7轉(zhuǎn)入在DC,，在隨后的體外觀察與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，都出現(xiàn)了明顯的CTL增多現(xiàn)象,，在細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中,，宮頸癌腫瘤特異的細(xì)胞毒中，發(fā)現(xiàn)CTL的功能顯著增強(qiáng),。他已將這種方法應(yīng)用于臨床,，一名在1997年經(jīng)過(guò)子宮切除術(shù)并接受了順鉑化療及體外放療的病人在2001年發(fā)現(xiàn)病情重新惡化，腫瘤又開(kāi)始擴(kuò)散,，Santin AD通過(guò)皮下注射共進(jìn)行了十五次DC治療,。為了增加對(duì)腫瘤敏感的T細(xì)胞數(shù)目，在第一次,，第二次及第四次注射前均將預(yù)先已被HPV18E7蛋白沖擊的DC刺激后產(chǎn)生的自體T細(xì)胞（1.5×107個(gè)細(xì)胞）先注入患者體內(nèi),， 72小時(shí)后再注入經(jīng)HPV18－E7沖擊的DC疫苗，頭五次DC治療以10到14天為間隔,，而且在每次注射時(shí)還加有低劑量的IL－2（106 U/平米體表面積·天）,。剩下的則以30到60天為間隔來(lái)進(jìn)行。在注射后,，病人出現(xiàn)了注射部位的腫脹及觸痛等過(guò)敏樣癥狀,，但組織活檢發(fā)現(xiàn)腫瘤受到明顯殺傷與抑制,。從開(kāi)始治療到患者又出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，共經(jīng)歷二十個(gè)月,，不僅生存期明顯延長(zhǎng)（24個(gè)月）,，而且患者生活質(zhì)量有明顯提高。
不僅完整的E6,、E7蛋白可以用來(lái)做為抗原來(lái)沖擊DC,，而且HPV的部分蛋白也可以用于刺激強(qiáng)化DC，該DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL都能對(duì)表達(dá)此種蛋白的靶細(xì)胞有較高的殺傷力,。有實(shí)驗(yàn)將HPV-16E7(11-20)肽和外周血PBMC在細(xì)胞因子作用下培養(yǎng),以后每周用經(jīng)放射線照射過(guò)的負(fù)載肽的PBMC刺激,同時(shí)還將除去DC4+Ｔ細(xì)胞的PBMC用轉(zhuǎn)染有HPV-16E7(11-20)的DC刺激,用51Cr釋放試驗(yàn)測(cè)細(xì)胞毒,7個(gè)供者中有1個(gè)建立了肽特異性CTL系;用負(fù)載肽的DC刺激富含CD8+Ｔ細(xì)胞的PBMC時(shí),7個(gè)供者中獲得4個(gè)CTL,主要的CTL能夠溶解HLA-A2+,、HPV-16+宮頸癌細(xì)胞系Caski,而HLA Ａ2-、HPV16+的宮頸癌細(xì)胞系SiHa僅在轉(zhuǎn)染HLA-Ａ2基因后才能被CTL溶解,。這種多肽抗原沖擊DC療法也已進(jìn)入臨床階段不僅如此,，用HPV16　E2蛋白C端的一部分刺激過(guò)的DC可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量能釋放較多IFN-γ的T細(xì)胞，而且其誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL也能特異性溶解表達(dá)E2蛋白的靶細(xì)胞,，通過(guò)表型分析,，都是CD3＋CD8＋T細(xì)胞，而沒(méi)有E2致敏的在DC誘導(dǎo)出的CTL則沒(méi)有這個(gè)效果,。
但是這種方法也有局限性,，首先就是其靶向性不高，特異性不是很強(qiáng),，其次,，由于蛋白降解及MHC分子循環(huán)，抗原蛋白多肽對(duì)DC來(lái)說(shuō),，并不是個(gè)有效的刺激物,，功能維持時(shí)間比較短。

2.1.3 HPV的DNA刺激致敏DC
DNA刺激的DC較蛋白抗原沖擊法有多個(gè)優(yōu)點(diǎn),，病毒DNA可以產(chǎn)生大量的蛋白作為抗原,，轉(zhuǎn)染后可能會(huì)持繼刺激產(chǎn)生特異CTL；病毒比蛋白更易進(jìn)入細(xì)胞,，再者病毒能更好進(jìn)行表位呈遞,，促進(jìn)HLAI類分子的表達(dá)（12）；宮頸癌細(xì)胞中大量存在的HPV16,、18的E6,、E7基因都是病毒原癌基因，其產(chǎn)生的E6,、E7蛋白能激活特異性的針對(duì)E6,、E7的CTL反應(yīng)。所以在宮頸癌的生物治療上,，DNA疫苗成為了一個(gè)熱點(diǎn),。Mauriizo比較了細(xì)胞裂解物刺激的DC,，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）－E7DNA刺激過(guò)的DC，以及腺相關(guān)病毒－SV40的Neo段－E7DNA（AAV/E7/Neo）刺激的DC在激發(fā)機(jī)體特異性免疫機(jī)體CTL上的異同,，發(fā)現(xiàn)三者都能激發(fā)特異性的CTL,，但在許多方面都存在很大差別。用AAV系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的DC細(xì)胞,，其表達(dá)CD80,、CD83的能力明顯強(qiáng)于其他DC，胞內(nèi)E7蛋白含量是另兩種的三到四倍,。AAV系統(tǒng)誘生的CTL的T細(xì)胞表型一直為CD8＋,，低表達(dá)CD56，分泌的IFN－γ也明顯高于其他系統(tǒng)誘發(fā)的CTL,。通過(guò)對(duì)兩名臨床標(biāo)本的作用,，發(fā)現(xiàn)該CTL效果比另兩種系統(tǒng)的強(qiáng)2～3倍.不僅如此，還發(fā)現(xiàn)通過(guò)不同注射途徑產(chǎn)生的免疫效果不同,，將轉(zhuǎn)有HPV18E7基因的DC通過(guò)肌肉注射所激發(fā)的免疫應(yīng)答比皮下注射或靜脈滴注都要強(qiáng),，能激發(fā)更多的E7特異性抗體及特異CD4＋、CD8＋T細(xì)胞前體細(xì)胞,。但由于HPV16,、18的E6、E7DNA本身具有致癌性,，所以直接應(yīng)用該DNA可能存在誘發(fā)癌癥的危險(xiǎn),。

2.1.4 HPV的RNA轉(zhuǎn)染DC
由于RNA不會(huì)整合到宿主的染色體上，所以用RNA疫苗在安全性上可能比DNA疫苗要高,。將來(lái)源于腫瘤組織的RNA轉(zhuǎn)染入DC后,，只會(huì)產(chǎn)生MHC－I類限制的應(yīng)答（15）。Thornberg等發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)編碼HPVE6,、E7蛋白的RNA沖擊過(guò)的DC，無(wú)論在體外或體內(nèi)均能激發(fā)出特異性的,、強(qiáng)烈的針對(duì)表達(dá)E6,、E7蛋白的靶細(xì)胞的CTL效應(yīng)，識(shí)別并溶解包括轉(zhuǎn)染E6,、E7RNA的樹突狀細(xì)胞在內(nèi)的靶細(xì)胞,，而且溶解宮頸癌細(xì)胞的能力比E6、E6多肽沖擊的DC所激發(fā)CTL反應(yīng)要強(qiáng),。并且還發(fā)現(xiàn),，同時(shí)轉(zhuǎn)染E6、E7 RNA的樹突狀細(xì)胞所激發(fā)的CTL反應(yīng)產(chǎn)生的溶解效果要優(yōu)于轉(zhuǎn)染單獨(dú)一種RNA,。

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2.1.5　VLPs沖擊DC細(xì)胞
HPV的晚期蛋白L1,，L2來(lái)源的病毒樣顆粒（virus-like particle.　VLPs）是沒(méi)有致癌性的病毒蛋白,，還發(fā)現(xiàn)對(duì)于L區(qū)的L1，在其羥基端可以攜帶60個(gè)氨基酸而不改變其形成VLP的能力,，所以可以在此部位融合上不同的限制性的CTL表位或其他免疫原性肽,，此為嵌合性病毒樣顆粒（Chimeric virus-like particles,CVLP）它能誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，所以它可以用做預(yù)防性和治療性疫苗,。將HPV－16的CVLP與未成熟DC共同培養(yǎng)48小時(shí)后,，DC表達(dá)CD80與CD83的能力明顯提高，分泌的IL－12也大大增加,。而且還發(fā)現(xiàn),，用嵌合HPV16L1L2－E7的VLPs,所沖擊的DC激發(fā)的CTL是針對(duì)表達(dá)E7多肽的靶細(xì)胞的(17)。這也為DC疫苗的發(fā)展提供了一個(gè)新的方向,。

2.2 細(xì)胞因子作用的樹突狀細(xì)胞疫苗
研究發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞－集落刺激因子（granulocyte/macrop
hage-clony-stimulating factor, GM-CSF）和白介素4(Interleukin-4,IL-4)共同作用下,，會(huì)使未成熟DC迅速成熟，并提高其抗原提呈能力,。將GM－CSF的基因通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)入與腫瘤細(xì)胞融合的DC細(xì)胞后,，DC在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中高表達(dá)B7和共刺激能力，其表達(dá)出的CTL殺傷力更高,而且它還能提高其他非特異性免疫細(xì)胞的抗腫瘤能力,。

2.3 強(qiáng)化DC表面配體
有研究表明,，腫瘤產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可調(diào)節(jié)Flt3配體而發(fā)揮對(duì)DC的作用，該配體是誘導(dǎo)造血前體細(xì)胞和DC擴(kuò)增的生長(zhǎng)因子,，在體外發(fā)現(xiàn)VEGF會(huì)抑制該配體,，使其表達(dá)下降，從而抑制DC成熟,，擴(kuò)增,。把Flt3 配體加入到含GM－CSF與IL－4的細(xì)胞培養(yǎng)液中后（40ng/ml），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的DC總數(shù)增加了約26%,，而這些DC的表型保持穩(wěn)定,，此配體還可以增強(qiáng)DC對(duì)T細(xì)胞的刺激能力，促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng),。況且,，前面提到的不少抗原都可以加強(qiáng)DC上CD80、CD83的表達(dá),。

3 結(jié)語(yǔ)：
樹突狀細(xì)胞疫苗在宮頸癌治療方面已取得了初步進(jìn)展,，有些已用于臨床，但大部分尚處于實(shí)驗(yàn)階段,，目前樹突狀細(xì)胞疫苗在實(shí)際應(yīng)用中存在許多疑問(wèn),，如免疫應(yīng)答的維持時(shí)間長(zhǎng)短，DC疫苗注射途徑，劑量,，次數(shù),，間隔時(shí)間，不良反應(yīng)及副作用等,。然而,，樹突狀細(xì)胞在宮頸癌的生物治療方面無(wú)疑具有光明的前景。