武春曉 綜述 馬大龍 審閱
北京大學人類疾病基因研究中心
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前言：我們的免疫系統(tǒng)具有驚人的適應能力,，這建立在體內由TCR和免疫球蛋白分子組成的巨大的特異性抗原受體譜的基礎之上,。而抗原受體的高度多樣性是在發(fā)育B和T淋巴細胞通過V(D)J基因重排過程產(chǎn)生的。V(D)J基因重排異常將嚴重影響抗原受體譜的產(chǎn)生，阻滯淋巴細胞的發(fā)育,，導致嚴重聯(lián)合免疫缺陷綜合癥SCID或Omenn 綜合癥等疾病1,。
體內V(D)J基因重排是多種分子參與的復雜過程，其分子機制已基本闡明,。大致可將它分為兩個階段：一,、 重排活化基因 RAG1和RAG2蛋白及其輔助DNA結合蛋白HMG1或HMG2特異性識別位于編碼基因片段側翼的重排信號序列RSS并在此將DNA切割開2；二,、非同源末端連接裝置（nonhomologous end-joining machinery,，NHEJ)將產(chǎn)生的斷裂DNA末端（信號區(qū)平末端和發(fā)夾結構編碼區(qū)末端）連接起來形成重排產(chǎn)物。NHEJ主要由廣泛表達的DNA ligase Ⅳ,、DNA-PK,、Ku70/Ku86、Artemis,、XRCC4等蛋白組成,。它們也參與其它DNA損傷修復過程3。
圖1
重排活化基因RAGs產(chǎn)物的正確時空特異性表達對獲得性免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育至關重要,。它的表達受嚴格的調控4,。值得一提的是近年來建立了綠色熒光蛋白GFP－RAG指示劑轉基因和基因打靶小鼠品系。由此可以在體內單細胞水平直接觀察RAG的表達,，從而有助于確定次級淋巴器官表達RAGS的細胞,，及發(fā)現(xiàn)參與調控RAG階段特異性和細胞系特異性表達的順式作用元件。這是研究RAG調控領域的取得的一大進展5,6,7,。
一,、RAG的結構及功能20
1. RAG基因結構
RAG 包括RAG1和RAG2，它們是一對非常獨特的基因,，最早出現(xiàn)在有齒魚,，在脊椎動物進化過程中高度保守。在人基因組,，它們以尾對尾的結構形式定位于11染色體11p13,，其編碼區(qū)位于單獨的一個外顯子。而且它們共同轉錄并被協(xié)同調控,。RAG基因的這些特性提示它們是由一個共同的轉座子插入起源而來,。RAG1和RAG2在體外的確表現(xiàn)有轉座子活性。兩個RAG都有一個非編碼的外顯子,，這可能是起源轉座子整合的宿主細胞序列,，此外顯子后來進化為淋巴系統(tǒng)特異性表達調控序列。在人RAG2,，有兩個變異剪切外顯子,，(exon 1A and exon 1B),。 Exon 1A構成主要起始位點，exon 1B是次要起始位點,。小鼠RAG2只有一個外顯子1,。
2.RAG蛋白結構及功能
通過大量的RAG蛋白突變體的研究，幫助我們確定了RAG蛋白的多個功能域,。（見圖2）,。人RAG1蛋白全長1008個氨基酸殘基，其氨基末端區(qū)域（1-386氨基酸殘基）有核定位信號,，特別是4個堿性區(qū)域BI,BIIa,，BIIb，BIII是核轉運蛋白SRP1的靶點,。兩個鋅指結構域C3HC4,C2H2參與RAG1蛋白的二聚體的形成,。RAG1蛋白的中心區(qū)域有兩個非常保守的功能域，其中392－448氨基酸殘基區(qū)域識別重組信號序列RSS,，將RAG1-RAG2蛋白復合體錨定在RSS區(qū),。另一個504-526氨基酸殘基區(qū)域是重組酶活性區(qū)域。與RAG2蛋白相互作用功能域定位于504-1008氨基酸殘基區(qū)域,，包含了活性中心和羧基末端區(qū)域,。
人RAG2蛋白全長包括517個蛋白氨基酸殘基，其活性中心位于氨基末端1-382氨基酸殘基區(qū)域,，其中1-355氨基酸殘基區(qū)域包含6個由50個氨基酸殘基組成的kelch/mipp重復基序,，它們介導蛋白－蛋白和蛋白－DNA相互作用。RAG2蛋白羧基末端區(qū)域非常保守,，可能介導與染色體蛋白之間的相互作用,。
圖2
3. RAG缺陷與疾病
對基因打靶小鼠動物模型的研究證明了RAG1和RAG2在V（D）J基因重排和淋巴系細胞發(fā)育中的關鍵性作用。rag1-/-和rag2 -/- 小鼠有同樣的表現(xiàn)型,，嚴重的T/B細胞早期發(fā)育組滯在,，T細胞停滯于CD3-CD4-CD8-CD25+階段，而B細胞停滯于B220-CD43+IgM-祖B細胞階段,。它們的外周血沒有成熟的循環(huán)T/B淋巴細胞,，這與人重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征SCID非常相似。而且,，都有V（D）J基因重排缺陷,。有人在14個SCID病人當中發(fā)現(xiàn)6例有不同的RAG基因突變，體外實驗證明這些突變導致RAG蛋白功能徹底缺失,。而在Omenn 綜合癥病人,，也有RAG基因突變，但體外實驗表明OS病人的RAG蛋白仍然保留部分V（D）J基因重排活性,。而OS病人的癥狀也較SCID病人輕,，外周血低免疫球蛋白血癥,，無循環(huán)B淋巴細胞，但有數(shù)目不同的成熟,，活化，寡克隆,，功能缺陷的T細胞,。
二、淋巴細胞發(fā)育過程中RAG的表達
1,、在早期淋巴細胞發(fā)育過程中RAG的表達
在淋巴系統(tǒng)生發(fā)過程中RAG基因是何時活化的,？T和B淋巴細胞共同來源于一個的不表達RAG1和RAG2祖細胞。在發(fā)育胸腺細胞中,，RAG表達和V(D)J重排最早出現(xiàn)于CD4-CD8(DN )-CD44+CD25+定向祖T細胞,。而第一個表達RAG1和RAG2的B細胞是AA4.1+HAS-CD4+CD43+祖B細胞。此B細胞也是定向發(fā)育的,，但其RAG表達水平低且無V(D)J重排5,8,。
RAG的表達水平隨B細胞成熟而增高，在AA4.1HSA-B220+CD4-CD43+pro-B細胞最早開始出現(xiàn)V(D)J重排,。但此時發(fā)生重排的細胞比例很低2/49,。到了HSA+B220+CD43+pro-B細胞RAG的水平和V(D)J重排率繼續(xù)增高。而所有分化成pre-B的細胞全都攜帶至少在一個等位基因位點的符合閱讀框架的V-D-J連接,。
在pre-B細胞免疫球蛋白重鏈的表達或在pre-T細胞β鏈的表達分別誘導免疫球蛋白重鏈和TCRβ鏈的等位基因排斥,。表面pre-BCR 和pre-TCR的表達分別啟動了pre-B細胞和pre-T細胞的幾輪增殖分化。同時,，等位基因排斥和增殖擴增在B和T細胞系均伴有RAG的表達下調6,8,。
2. 在pre-B和DP-T細胞中RAG的表達
pre-B細胞或pre-T細胞的幾輪增殖擴增之后，在CD25+pre-BⅡ和CD4+CD8+ DP T細胞開始了RAG的第二波表達,。同時免疫球蛋白輕鏈和TCR鏈基因的重排速度加快9,。
3. 二次V(D)J重排
TCRα鏈基因的有效重排結果導致完整的αβTCR的細胞表面表達。但這并不終止V(D)J重排,。RAG的表達和TCRα鏈的基因重排過程一直持續(xù)到胸腺陽性選擇發(fā)生TCR交聯(lián)時才終止,。由于V(D)J重排的隨機性，開始大約有2/3重排基因不符合閱讀框架,，這些DP-T細胞開始產(chǎn)生的受體不被陽性選擇,。而通過這種持續(xù)性的TCRα鏈基因二次重排，則有可能挽救這些細胞,，從而提高T細胞的生成效率10,。
在DP-T細胞，TCR的交聯(lián)終止RAG的表達,；而在骨髓,，未成熟B細胞表面受體的結合反而會誘導RAG的持續(xù)表達和受體編輯,，這將防止自身特異性BCR的產(chǎn)生，并阻滯自身反應性B細胞的發(fā)育12,。
4. RAG表達的終止
成熟的T或B細胞不表達RAG,。發(fā)育過程中的DP T細胞RAG的表達終止于陽性選擇；雖然未成熟B細胞確實表達RAG mRNA和蛋白,，但RAG mRNA的水平與細胞表面IgM的水平負相關,，而后者隨著未成熟B細胞的發(fā)育成熟而逐漸增高。等到未成熟B細胞選擇性進入長壽命B細胞室時,，RAG的表達才完全終止,。有實驗表明，在未成熟的外周B細胞,，其表面受體的交聯(lián)會終止RAG的表達11,。
5. RAG的表達與抗原反應
生發(fā)中心（GC）是體內抗原應答時B細胞克隆擴增的區(qū)域。這一結構也是體細胞突變和選擇發(fā)生的區(qū)域,。有人用免疫組化的方法在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)RAG的表達,，并推測B細胞RAG的再次誘導表達是GC反應的一部分，因此GC區(qū)的V(D)J重排也構成另一種抗體親和力成熟的機制13,。
但在GFP轉基因指示劑小鼠和基因打靶指示劑小鼠發(fā)現(xiàn),，在脾內有少量的表達RAG的未成熟B細胞，其數(shù)量在免疫后增高,。這些未成熟B細胞一般不是GC細胞,，但可以參與免疫應答，并進入GC區(qū),。而且,，一旦未成熟B細胞RAG的表達終止，就不會再次被誘導表達,。而純化的成熟B細胞在體外用絲裂原或過繼傳輸后免疫均不會再表達RAG5,7,13,。
三、RAG的表達調控
對V(D)J基因重排事件的精確調控,，及將其限制于一定的微環(huán)境中,，將有助于確保基因組的整體完整,。因此一定有一個對V(D)J基因重排機器,，包括RAG表達的嚴格的組織特異性、細胞系特異性,、和發(fā)育特異性的調控機制,。
RAG1和RAG2表達調節(jié)發(fā)生在三個水平上：轉錄，轉錄體穩(wěn)定性，和磷酸化介導的蛋白降解,。其中主要的是轉錄起始水平的調節(jié),。研究RAG的順式作用元件和轉錄因子的研究有助于闡明其調控機制14。
1. RAG的啟動子15－20
人RAG1的最小基礎啟動子定位于其主要轉錄起始位點－111到＋97個核苷酸區(qū),。它在淋巴和非淋巴樣細胞均有活性,。該啟動子沒有啟動基序和功能性的TATA盒，其中的一個A/T高度富含區(qū)可能是轉錄因子THⅡD的結合位點,。RAG1啟動子中有潛在的E2A-,IKAROS- 和ETS 家族轉錄因子等多個識別位點,。另外，還可檢測到PEPBS/CBF和Y-BOX/CCAAT共有序列基序,。核因子Y（NF-Y）結合到RAG1的Y-BOX基序；對此基序的突變可阻斷NF-Y轉錄因子的結合,，并顯著降低RAG1啟動子活性,。NF-Y可以與cAMP反應元件結合蛋白相互作用。因為RAG1的表達對cAMP信號反應,，因此NF-Y位點可能于一個未知的cAMP反應元件相互作用,。人和小鼠RAG1啟動子高度同源。
人RAG2啟動子沒有TATA,；但在其主要轉錄起始位點－34位置有一個GATAA共同基序,。人RAG2啟動子在淋巴和非淋巴細胞系都有活性。提示人啟動子以外的調控元件可能參與了組織特異性的轉錄調控,。而小鼠RAG2啟動子只在淋巴系細胞有活性,，提示其中含有調控RAG2組織特異性表達的順式元件。而且,，在B細胞和T細胞,，B細胞系特異性轉錄因子PAX5，T細胞系特異性轉錄因子GATA-3分別結合在轉錄起始位點-80-17區(qū),。對此區(qū)域的突變降低了在B和T細胞的啟動子活性,。提示不同的DNA結合蛋白，PAX5,，GATA-3分別在B和T細胞調節(jié)小鼠啟動子活性,。在小鼠T細胞系，轉錄因子c-Myb結合RAG2啟動子近端的一個Myb共有位點,，是RAG2啟動子在T細胞系的活性的必需正向調節(jié)因子,。而在小鼠B細胞系，c-Myb和PAX5共同結合并協(xié)同活化RAG2啟動子,，蛋白缺失體實驗表明c-Myb C末端結構域介導了兩者的相互作用,。在RAG2啟動子5'端，有一含GA-box的G富含區(qū),，可特異性結合轉錄因子SP1,，對RAG2啟動子的完全活性起輔助調節(jié)作用,。
2染色體結構改變和RAG增強子19，21,。
在人RAG1基因上游相鄰的24KB染色體DNA片段發(fā)現(xiàn)了至少4個淋巴細胞系特異性DNase I高度敏感位點（HS1,HS2,HS3,，HS4），其中,，HS1在多種細胞系中可以檢測到,；HS2,3,4為淋巴細胞系特異；HS3與啟動子區(qū)有部分重疊,。這些DNase I高度敏感位點在小鼠與人中非常保守,。
在表達小鼠RAG2的pre-B細胞系RAG2基因上游相鄰的25KB染色體DNA片段發(fā)現(xiàn)了3個淋巴細胞系特異性DNase I高度敏感位點（HS1,HS2,HS3）。HS3位于RAG2啟動子區(qū),，只與表達RAG2細胞系相關,。在HS1和HS2相應區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個增強子元件，其中一個增強子元件D3,，只在淋巴細胞系有增強子活性,；只在初級淋巴組織有活性，在次級淋巴組織和非淋巴組織無活性,；只在CD4(-)CD8(-)胸腺細胞有活性, CD4(+)CD8(+) 或 CD4(+)CD8(-)胸腺細胞無活性,；在骨髓in B220(+)IgM(-)細胞有活性, B220(+)IgM(+)細胞無活性。進一步 實驗提示C/EBP轉錄因子可能結合D3增強子而產(chǎn)生活性,。
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武春曉 博士研究生 北京大學人類疾病基因研究中心
馬大龍 教授，博士生導師,， 北京大學基礎醫(yī)學院免疫學系,，北京大學人類疾病基因研究中心
