武春曉 綜述 馬大龍 審閱
北京大學(xué)人類疾病基因研究中心
--------------------------------------------------------------------------------
前言：我們的免疫系統(tǒng)具有驚人的適應(yīng)能力，這建立在體內(nèi)由TCR和免疫球蛋白分子組成的巨大的特異性抗原受體譜的基礎(chǔ)之上,。而抗原受體的高度多樣性是在發(fā)育B和T淋巴細(xì)胞通過V(D)J基因重排過程產(chǎn)生的。V(D)J基因重排異常將嚴(yán)重影響抗原受體譜的產(chǎn)生,，阻滯淋巴細(xì)胞的發(fā)育,，導(dǎo)致嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合癥SCID或Omenn 綜合癥等疾病1。
體內(nèi)V(D)J基因重排是多種分子參與的復(fù)雜過程,，其分子機(jī)制已基本闡明。大致可將它分為兩個階段：一,、 重排活化基因 RAG1和RAG2蛋白及其輔助DNA結(jié)合蛋白HMG1或HMG2特異性識別位于編碼基因片段側(cè)翼的重排信號序列RSS并在此將DNA切割開2,；二、非同源末端連接裝置（nonhomologous end-joining machinery,，NHEJ)將產(chǎn)生的斷裂DNA末端（信號區(qū)平末端和發(fā)夾結(jié)構(gòu)編碼區(qū)末端）連接起來形成重排產(chǎn)物,。NHEJ主要由廣泛表達(dá)的DNA ligase Ⅳ、DNA-PK,、Ku70/Ku86,、Artemis、XRCC4等蛋白組成,。它們也參與其它DNA損傷修復(fù)過程3,。
圖1
重排活化基因RAGs產(chǎn)物的正確時空特異性表達(dá)對獲得性免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要。它的表達(dá)受嚴(yán)格的調(diào)控4,。值得一提的是近年來建立了綠色熒光蛋白GFP－RAG指示劑轉(zhuǎn)基因和基因打靶小鼠品系,。由此可以在體內(nèi)單細(xì)胞水平直接觀察RAG的表達(dá)，從而有助于確定次級淋巴器官表達(dá)RAGS的細(xì)胞,，及發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控RAG階段特異性和細(xì)胞系特異性表達(dá)的順式作用元件,。這是研究RAG調(diào)控領(lǐng)域的取得的一大進(jìn)展5,6,7。
一,、RAG的結(jié)構(gòu)及功能20
1. RAG基因結(jié)構(gòu)
RAG 包括RAG1和RAG2,，它們是一對非常獨特的基因，最早出現(xiàn)在有齒魚,，在脊椎動物進(jìn)化過程中高度保守,。在人基因組，它們以尾對尾的結(jié)構(gòu)形式定位于11染色體11p13,，其編碼區(qū)位于單獨的一個外顯子,。而且它們共同轉(zhuǎn)錄并被協(xié)同調(diào)控。RAG基因的這些特性提示它們是由一個共同的轉(zhuǎn)座子插入起源而來,。RAG1和RAG2在體外的確表現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子活性,。兩個RAG都有一個非編碼的外顯子，這可能是起源轉(zhuǎn)座子整合的宿主細(xì)胞序列,，此外顯子后來進(jìn)化為淋巴系統(tǒng)特異性表達(dá)調(diào)控序列,。在人RAG2,，有兩個變異剪切外顯子，(exon 1A and exon 1B),。 Exon 1A構(gòu)成主要起始位點,，exon 1B是次要起始位點。小鼠RAG2只有一個外顯子1,。
2.RAG蛋白結(jié)構(gòu)及功能
通過大量的RAG蛋白突變體的研究,，幫助我們確定了RAG蛋白的多個功能域。（見圖2）,。人RAG1蛋白全長1008個氨基酸殘基,，其氨基末端區(qū)域（1-386氨基酸殘基）有核定位信號，特別是4個堿性區(qū)域BI,BIIa,，BIIb,，BIII是核轉(zhuǎn)運蛋白SRP1的靶點。兩個鋅指結(jié)構(gòu)域C3HC4,C2H2參與RAG1蛋白的二聚體的形成,。RAG1蛋白的中心區(qū)域有兩個非常保守的功能域,，其中392－448氨基酸殘基區(qū)域識別重組信號序列RSS，將RAG1-RAG2蛋白復(fù)合體錨定在RSS區(qū),。另一個504-526氨基酸殘基區(qū)域是重組酶活性區(qū)域,。與RAG2蛋白相互作用功能域定位于504-1008氨基酸殘基區(qū)域，包含了活性中心和羧基末端區(qū)域,。
人RAG2蛋白全長包括517個蛋白氨基酸殘基,，其活性中心位于氨基末端1-382氨基酸殘基區(qū)域，其中1-355氨基酸殘基區(qū)域包含6個由50個氨基酸殘基組成的kelch/mipp重復(fù)基序,，它們介導(dǎo)蛋白－蛋白和蛋白－DNA相互作用,。RAG2蛋白羧基末端區(qū)域非常保守，可能介導(dǎo)與染色體蛋白之間的相互作用,。
圖2
3. RAG缺陷與疾病
對基因打靶小鼠動物模型的研究證明了RAG1和RAG2在V（D）J基因重排和淋巴系細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵性作用,。rag1-/-和rag2 -/- 小鼠有同樣的表現(xiàn)型，嚴(yán)重的T/B細(xì)胞早期發(fā)育組滯在,，T細(xì)胞停滯于CD3-CD4-CD8-CD25+階段,，而B細(xì)胞停滯于B220-CD43+IgM-祖B細(xì)胞階段。它們的外周血沒有成熟的循環(huán)T/B淋巴細(xì)胞,，這與人重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征SCID非常相似,。而且，都有V（D）J基因重排缺陷,。有人在14個SCID病人當(dāng)中發(fā)現(xiàn)6例有不同的RAG基因突變,，體外實驗證明這些突變導(dǎo)致RAG蛋白功能徹底缺失。而在Omenn 綜合癥病人,，也有RAG基因突變,，但體外實驗表明OS病人的RAG蛋白仍然保留部分V（D）J基因重排活性,。而OS病人的癥狀也較SCID病人輕，外周血低免疫球蛋白血癥,，無循環(huán)B淋巴細(xì)胞,，但有數(shù)目不同的成熟，活化,，寡克隆,，功能缺陷的T細(xì)胞。
二,、淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中RAG的表達(dá)
1,、在早期淋巴細(xì)胞發(fā)育過程中RAG的表達(dá)
在淋巴系統(tǒng)生發(fā)過程中RAG基因是何時活化的？T和B淋巴細(xì)胞共同來源于一個的不表達(dá)RAG1和RAG2祖細(xì)胞,。在發(fā)育胸腺細(xì)胞中，RAG表達(dá)和V(D)J重排最早出現(xiàn)于CD4-CD8(DN )-CD44+CD25+定向祖T細(xì)胞,。而第一個表達(dá)RAG1和RAG2的B細(xì)胞是AA4.1+HAS-CD4+CD43+祖B細(xì)胞,。此B細(xì)胞也是定向發(fā)育的，但其RAG表達(dá)水平低且無V(D)J重排5,8,。
RAG的表達(dá)水平隨B細(xì)胞成熟而增高,，在AA4.1HSA-B220+CD4-CD43+pro-B細(xì)胞最早開始出現(xiàn)V(D)J重排。但此時發(fā)生重排的細(xì)胞比例很低2/49,。到了HSA+B220+CD43+pro-B細(xì)胞RAG的水平和V(D)J重排率繼續(xù)增高,。而所有分化成pre-B的細(xì)胞全都攜帶至少在一個等位基因位點的符合閱讀框架的V-D-J連接。
在pre-B細(xì)胞免疫球蛋白重鏈的表達(dá)或在pre-T細(xì)胞β鏈的表達(dá)分別誘導(dǎo)免疫球蛋白重鏈和TCRβ鏈的等位基因排斥,。表面pre-BCR 和pre-TCR的表達(dá)分別啟動了pre-B細(xì)胞和pre-T細(xì)胞的幾輪增殖分化,。同時，等位基因排斥和增殖擴(kuò)增在B和T細(xì)胞系均伴有RAG的表達(dá)下調(diào)6,8,。
2. 在pre-B和DP-T細(xì)胞中RAG的表達(dá)
pre-B細(xì)胞或pre-T細(xì)胞的幾輪增殖擴(kuò)增之后,，在CD25+pre-BⅡ和CD4+CD8+ DP T細(xì)胞開始了RAG的第二波表達(dá)。同時免疫球蛋白輕鏈和TCR鏈基因的重排速度加快9,。
3. 二次V(D)J重排
TCRα鏈基因的有效重排結(jié)果導(dǎo)致完整的αβTCR的細(xì)胞表面表達(dá),。但這并不終止V(D)J重排。RAG的表達(dá)和TCRα鏈的基因重排過程一直持續(xù)到胸腺陽性選擇發(fā)生TCR交聯(lián)時才終止,。由于V(D)J重排的隨機(jī)性,，開始大約有2/3重排基因不符合閱讀框架，這些DP-T細(xì)胞開始產(chǎn)生的受體不被陽性選擇,。而通過這種持續(xù)性的TCRα鏈基因二次重排,，則有可能挽救這些細(xì)胞，從而提高T細(xì)胞的生成效率10,。
在DP-T細(xì)胞,，TCR的交聯(lián)終止RAG的表達(dá),；而在骨髓，未成熟B細(xì)胞表面受體的結(jié)合反而會誘導(dǎo)RAG的持續(xù)表達(dá)和受體編輯,，這將防止自身特異性BCR的產(chǎn)生,，并阻滯自身反應(yīng)性B細(xì)胞的發(fā)育12。
4. RAG表達(dá)的終止
成熟的T或B細(xì)胞不表達(dá)RAG,。發(fā)育過程中的DP T細(xì)胞RAG的表達(dá)終止于陽性選擇,；雖然未成熟B細(xì)胞確實表達(dá)RAG mRNA和蛋白，但RAG mRNA的水平與細(xì)胞表面IgM的水平負(fù)相關(guān),，而后者隨著未成熟B細(xì)胞的發(fā)育成熟而逐漸增高,。等到未成熟B細(xì)胞選擇性進(jìn)入長壽命B細(xì)胞室時，RAG的表達(dá)才完全終止,。有實驗表明,，在未成熟的外周B細(xì)胞，其表面受體的交聯(lián)會終止RAG的表達(dá)11,。
5. RAG的表達(dá)與抗原反應(yīng)
生發(fā)中心（GC）是體內(nèi)抗原應(yīng)答時B細(xì)胞克隆擴(kuò)增的區(qū)域,。這一結(jié)構(gòu)也是體細(xì)胞突變和選擇發(fā)生的區(qū)域。有人用免疫組化的方法在此區(qū)域發(fā)現(xiàn)RAG的表達(dá),，并推測B細(xì)胞RAG的再次誘導(dǎo)表達(dá)是GC反應(yīng)的一部分,，因此GC區(qū)的V(D)J重排也構(gòu)成另一種抗體親和力成熟的機(jī)制13。
但在GFP轉(zhuǎn)基因指示劑小鼠和基因打靶指示劑小鼠發(fā)現(xiàn),，在脾內(nèi)有少量的表達(dá)RAG的未成熟B細(xì)胞,，其數(shù)量在免疫后增高。這些未成熟B細(xì)胞一般不是GC細(xì)胞,，但可以參與免疫應(yīng)答,，并進(jìn)入GC區(qū)。而且,，一旦未成熟B細(xì)胞RAG的表達(dá)終止,，就不會再次被誘導(dǎo)表達(dá)。而純化的成熟B細(xì)胞在體外用絲裂原或過繼傳輸后免疫均不會再表達(dá)RAG5,7,13,。
三,、RAG的表達(dá)調(diào)控
對V(D)J基因重排事件的精確調(diào)控，及將其限制于一定的微環(huán)境中,，將有助于確?；蚪M的整體完整。因此一定有一個對V(D)J基因重排機(jī)器,，包括RAG表達(dá)的嚴(yán)格的組織特異性,、細(xì)胞系特異性、和發(fā)育特異性的調(diào)控機(jī)制,。
RAG1和RAG2表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)生在三個水平上：轉(zhuǎn)錄,，轉(zhuǎn)錄體穩(wěn)定性,，和磷酸化介導(dǎo)的蛋白降解。其中主要的是轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)節(jié),。研究RAG的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子的研究有助于闡明其調(diào)控機(jī)制14,。
1. RAG的啟動子15－20
人RAG1的最小基礎(chǔ)啟動子定位于其主要轉(zhuǎn)錄起始位點－111到＋97個核苷酸區(qū)。它在淋巴和非淋巴樣細(xì)胞均有活性,。該啟動子沒有啟動基序和功能性的TATA盒,，其中的一個A/T高度富含區(qū)可能是轉(zhuǎn)錄因子THⅡD的結(jié)合位點。RAG1啟動子中有潛在的E2A-,IKAROS- 和ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子等多個識別位點,。另外,，還可檢測到PEPBS/CBF和Y-BOX/CCAAT共有序列基序。核因子Y（NF-Y）結(jié)合到RAG1的Y-BOX基序,；對此基序的突變可阻斷NF-Y轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,，并顯著降低RAG1啟動子活性。NF-Y可以與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白相互作用,。因為RAG1的表達(dá)對cAMP信號反應(yīng),，因此NF-Y位點可能于一個未知的cAMP反應(yīng)元件相互作用。人和小鼠RAG1啟動子高度同源,。
人RAG2啟動子沒有TATA；但在其主要轉(zhuǎn)錄起始位點－34位置有一個GATAA共同基序,。人RAG2啟動子在淋巴和非淋巴細(xì)胞系都有活性,。提示人啟動子以外的調(diào)控元件可能參與了組織特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而小鼠RAG2啟動子只在淋巴系細(xì)胞有活性,，提示其中含有調(diào)控RAG2組織特異性表達(dá)的順式元件,。而且，在B細(xì)胞和T細(xì)胞,，B細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子PAX5,，T細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3分別結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點-80-17區(qū)。對此區(qū)域的突變降低了在B和T細(xì)胞的啟動子活性,。提示不同的DNA結(jié)合蛋白,，PAX5，GATA-3分別在B和T細(xì)胞調(diào)節(jié)小鼠啟動子活性,。在小鼠T細(xì)胞系,，轉(zhuǎn)錄因子c-Myb結(jié)合RAG2啟動子近端的一個Myb共有位點，是RAG2啟動子在T細(xì)胞系的活性的必需正向調(diào)節(jié)因子,。而在小鼠B細(xì)胞系,，c-Myb和PAX5共同結(jié)合并協(xié)同活化RAG2啟動子，蛋白缺失體實驗表明c-Myb C末端結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了兩者的相互作用,。在RAG2啟動子5'端,，有一含GA-box的G富含區(qū),，可特異性結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子SP1，對RAG2啟動子的完全活性起輔助調(diào)節(jié)作用,。
2染色體結(jié)構(gòu)改變和RAG增強子19,，21。
在人RAG1基因上游相鄰的24KB染色體DNA片段發(fā)現(xiàn)了至少4個淋巴細(xì)胞系特異性DNase I高度敏感位點（HS1,HS2,HS3,，HS4）,，其中，HS1在多種細(xì)胞系中可以檢測到,；HS2,3,4為淋巴細(xì)胞系特異,；HS3與啟動子區(qū)有部分重疊。這些DNase I高度敏感位點在小鼠與人中非常保守,。
在表達(dá)小鼠RAG2的pre-B細(xì)胞系RAG2基因上游相鄰的25KB染色體DNA片段發(fā)現(xiàn)了3個淋巴細(xì)胞系特異性DNase I高度敏感位點（HS1,HS2,HS3）,。HS3位于RAG2啟動子區(qū)，只與表達(dá)RAG2細(xì)胞系相關(guān),。在HS1和HS2相應(yīng)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了兩個增強子元件,，其中一個增強子元件D3，只在淋巴細(xì)胞系有增強子活性,；只在初級淋巴組織有活性,，在次級淋巴組織和非淋巴組織無活性；只在CD4(-)CD8(-)胸腺細(xì)胞有活性, CD4(+)CD8(+) 或 CD4(+)CD8(-)胸腺細(xì)胞無活性,；在骨髓in B220(+)IgM(-)細(xì)胞有活性, B220(+)IgM(+)細(xì)胞無活性,。進(jìn)一步 實驗提示C/EBP轉(zhuǎn)錄因子可能結(jié)合D3增強子而產(chǎn)生活性。
1. Vicky L Brandt and David B Roth ：A recombinase diversified: new functions of the RAG proteins. Current Opinion in Immunology 2002, 14:224-229
2. van Gent DC, Ramsden DA, Gellert M: The RAG1 and RAG2 proteins establish the 12/23 rule in V(D)J recombination. Cell 1996, 85:107-113.
3. Bassing CH, Alt FW, Hughes MM, D'Auteuil M, Wehrly TD,?Woodman BB, Gartner F, White JM, Davidson L, Sleckman BP: Recombination signal sequences restrict chromosomal V(D)J recombination beyond the 12/23 rule. Nature 2000, 05:583-586.
4. Hitoshi Nagaoka, Wong Yu and Michel C Nussenzweig： Regulation of RAG expression in developing lymphocytes.. Current Opinion in Immunology 2000, 12:187-190
5. Yu W, Nagaoka H, Jankovic M, Misulovin Z, Suh H, Rolink A, Melchers F, Meffre E, Nussenzweig MC: Continued RAG expression in latestages of B cell development and no apparent re-induction afterimmunization. Nature 1999, 400:682-687.
6. Yu W, Misulovin Z, Suh H, Hardy RR, Jankovic M, Yannoutsos N, Nussenzweig MC: Coordinate regulation of RAG1 and RAG2 bycell type-specific DNA elements 5￠ ￠ of RAG2. Science 1999,285:1080-1084.
7. Monroe RJ, Seidl KJ, Gaertner F, Han S, Chen F, Sekiguchi J, Wang J, Ferrini R, Davidson L, Kelsoe G, Alt FW: RAG2:GFP knockin mice reveal novel aspects of RAG2 expression in primary and peripheral lymphoid tissues. Immunity 1999, 11:201-212.
8. Allman D, Li J, Hardy RR: Commitment to the B lymphoid lineage occurs before DH-JH recombination. J Exp Med 1999, 189:735-740.
9. periphery. They are potentially useful as tools to further Wilson A, Held W, MacDonald HR: Two waves of recombinase gene expression in developing thymocytes. J Exp Med 1994, 179:1355-1360.
10 Borgulya P, Kishi H, Uematsu Y, von Boehmer H: Exclusion and inclusion of alpha and beta T cell receptor alleles. Cell 1992, 69:529-537.
11 Turka LA, Schatz DG, Oettinger MA, Chun JJ, Gorka C, Lee K, McCormack WT, Thompson CB: Thymocyte expression of RAG-1 and RAG-2: termination by T cell receptor cross-linking. Science 1991, 253:778-781.
12 Melamed D, Benschop RJ, Cambier JC, Nemazee D: Developmental ?regulation of B lymphocyte immune tolerance compartmentalizes clonal selection from receptor selection. Cell 1998, 92:173-182.
13 Meffre E, Papavasiliou F, Cohen P, de Bouteiller O, Bell D, Karasuyama H, Schiff C, Banchereau J, Liu YJ, Nussenzweig MC: Antigen receptor engagement turns off the V(D)J recombination machinery in human tonsil B cells. J Exp Med 1998, 188:765-772.
14 Ivan C. Fong a, *, Ali A. Zarrin b , Gillian E. Wu c , Neil L. Berinstein ：Functional analysis of the human RAG 2 promoter Molecular Immunology 37 (2000) 391-402
15 Zarrin AA, Fong I, Malkin L, Marsden PA, Berinstein NL： Cloning and characterization of the human recombination activating gene 1 (RAG1) and RAG2 promoter regions. J Immunol 1997 Nov 1;159(9):4382-94
16Monroe RJ, Chen F, Ferrini R, Davidson L, Alt FW. RAG2 is regulated differentially in B and T cells by elements 5' of the promoter. Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Oct 26;96(22):12713-8
17 Wang QF, Lauring J, Schlissel MS.: c-Myb binds to a sequence in the proximal region of the RAG-2 promoter and is essential for promoter activity in T-lineage cells. Mol Cell Biol 2000 Dec;20(24):9203-11
18 Miranda GA, Villalvazo M, Galic Z, Alva J, Abrines R, Yates Y, Evans CJ, Aguilera RJ.: Combinatorial regulation of the murine RAG-2 promoter by Sp1 and distinct lymphocyte-specific transcription factors. Mol Immunol 2002 Jun;38(15):1151-9
19 Wei XC, Kishi H, Jin ZX, Zhao WP, Kondo S, Matsuda T, Saito S, Muraguchi A. Characterization of chromatin structure and enhancer elements for murine recombination activating gene-2. J Immunol. 2002 Jul 15;169(2):873-81.
20 Luigi D Notarangelo. RAG and RAG defects. Current Opinion in Immunology 1999,，11：435-442
20.Kishi H, Jin ZX, Wei XC, Nagata T, Matsuda T, Saito S, Muraguchi ：A.Cooperative binding of c-Myb and Pax-5 activates the RAG-2 promoter in immature B cells. Blood. 2002 Jan 15;99(2):576-83.
21 Kitagawa T, Mori K, Kishi H, Tagoh H, Nagata T, Kurioka H, Muraguchi A：Chromatin structure and transcriptional regulation of human RAG-1 gene. Blood 1996 Nov 5;88(10):3785-91
--------------------------------------------------------------------------------
武春曉 博士研究生 北京大學(xué)人類疾病基因研究中心
馬大龍 教授,，博士生導(dǎo)師， 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系,，北京大學(xué)人類疾病基因研究中心
