任華 譯 黃靜 校譯
（華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,，上海200062）
通過(guò)將目的基因?qū)氘惓＜?xì)胞中以減緩破壞性疾病,，這一概念是十分吸引人的,。然而,，至今轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因治療中成功率還很低,。不過(guò),，重癥聯(lián)合性免疫缺陷病是一種有用的模型,，因?yàn)橥ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)基因可以選擇性地賦予轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞某些有利特性,，由此為基因治療提供有力證據(jù)。
獲得性免疫反應(yīng)有時(shí)會(huì)降低,。人體內(nèi)一些自然突變都伴隨有T細(xì)胞發(fā)育受阻的特征,，同時(shí)也直接或間接地伴隨著B(niǎo)細(xì)胞免疫功能下降，而且臨床結(jié)果發(fā)現(xiàn)機(jī)體易受致病微生物的侵染,，因此它們被統(tǒng)稱為重癥聯(lián)合性免疫缺陷綜合癥（SCIDs）,。重癥聯(lián)合性免疫缺陷綜合癥根據(jù)病理生理學(xué)特征可分為四類（圖1）。對(duì)大多數(shù)病例都進(jìn)行了分子機(jī)制的鑒定,，而在一些病例中確認(rèn)特定基因產(chǎn)物在淋巴細(xì)胞發(fā)育中的重要作用,。人們很快認(rèn)識(shí)到重癥聯(lián)合性免疫缺陷綜合癥有望成為評(píng)估基因治療的模型。確實(shí),，存在各種綜合因素使得基因治療免疫缺陷癥令人歡喜,，例如，能找出導(dǎo)致SCID疾病的缺陷基因,，鑒定疾病的嚴(yán)重性,，操縱造血干細(xì)胞的可能性，同種異型干細(xì)胞移植的效力（雖然干細(xì)胞存活率不令人滿意）和免疫反應(yīng)的糾正,。這就是為什么一旦第一個(gè)與SCID疾病相關(guān)的基因,，腺苷脫氨酶基因被鑒定出來(lái)后，腺苷脫氨酶（ADA）基因缺陷癥就被一些實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)作為基因治療的疾病模型,，這導(dǎo)致了1990年第一例基因治療實(shí)現(xiàn),。盡管人們獲得了不少信息，在接下來(lái)的試驗(yàn)中,，轉(zhuǎn)基因并沒(méi)有糾正免疫缺陷,。盡管如此,，這些尖端研究為另一SCID疾病--X染色體相關(guān)的SCID（SCID-X）基因治療研究提供了基礎(chǔ)：這種病是由細(xì)胞因子受體鏈基因（γc）缺失造成,。（2000年報(bào)道）
ADA轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中獲得的教訓(xùn)
1972年,，人們認(rèn)識(shí)到ADA缺陷是SCID疾病的一種,，1984年與此相關(guān)的基因被克隆。人們發(fā)現(xiàn),，拿出該基因進(jìn)行表達(dá)和行使管家功能的那部分編碼區(qū),，便可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因了,。莫洛尼鼠類肉瘤病毒(一種逆轉(zhuǎn)錄病毒)可作為載體把ADA基因轉(zhuǎn)入淋巴細(xì)胞生成祖先或成熟的淋巴細(xì)胞中,。此逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能轉(zhuǎn)染造血祖細(xì)胞并把轉(zhuǎn)基因插入到靶細(xì)胞基因組。此載體來(lái)源于鼠類致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒,。使用異種移植模型可觀測(cè)到ADA基因缺失的T細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)基因后存活和行使其功能,。與此同時(shí)，另一種治療也很有效,，即注射用PEG化的腺苷脫氨酶（PEG-ADA）的使用,，腺苷脫氨酶與PEG偶聯(lián)后穩(wěn)定性增加。ADA缺陷病人因?yàn)锳DA的缺乏,，其毒性底物不斷積累,，若為其每周注射PEG-ADA，便能有效地替代缺失酶的功能,。因此,，淋巴細(xì)胞發(fā)育得到恢復(fù)，并足以讓一些病人存活,。
這些研究暗示基因治療發(fā)展可超越ADA缺陷病研究范圍,。首先，將ADA基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞體現(xiàn)了一種可行途徑,。這是一種吸引人的方法,，因?yàn)門細(xì)胞很容易引發(fā)體內(nèi)循環(huán)，故可有效利用逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞,。因此,，進(jìn)行可行性試驗(yàn)后，第一例ADA缺陷臨床基因治療試驗(yàn)便開(kāi)展了,。兩位ADA缺陷病人自愿加入,，隨后日本又有第三位病人加入。這一臨床試驗(yàn)產(chǎn)生一些有趣的結(jié)果（BOX 2）,。結(jié)果表明在體內(nèi)血液中得到大量轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的可能性,，并且給病人注射大量轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞未產(chǎn)生不良反應(yīng)。尤其是轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合入基因組,，作為插入突變并沒(méi)有導(dǎo)致有害后果,。這告訴我們，比起其它任何一種實(shí)驗(yàn)方法,，也許使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)?shù)?。第二，至少在一位病人身上,，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞仍可在基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后8至10年被檢測(cè)到,。這最有效證明了人體內(nèi)T細(xì)胞壽命，也是基因治療淋巴系統(tǒng)疾病令人鼓舞的結(jié)果。然而,，大部分循環(huán)T細(xì)胞并未被轉(zhuǎn)導(dǎo),，因?yàn)檠芯空邆儾辉试S撤消PEG-ADA治療。這就不能得知是否ADA基因轉(zhuǎn)入T細(xì)胞并給這些病人帶來(lái)任何好處,。
同時(shí),，一些研究組有著野心勃勃的目標(biāo)，通過(guò)在造血祖細(xì)胞中插入ADA基因而永久地糾正ADA缺陷,。他們開(kāi)展了三個(gè)試驗(yàn)：使用兩個(gè)載體感染外周T細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞試驗(yàn),；以新生兒索血祖細(xì)胞為目標(biāo)的試驗(yàn)；和以老年病人骨髓細(xì)胞為目標(biāo)的試驗(yàn),。這兒,，再次所有的病人也要接受PEG-ADA治療。雖然,，整個(gè)結(jié)果令人失望（與預(yù)期結(jié)果相比）,，我們?nèi)缘玫揭恍┯袃r(jià)值的教訓(xùn)。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,，三個(gè)病人接受自身轉(zhuǎn)導(dǎo)索血細(xì)胞,，一小部分白血球被轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能維持八年,。與轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓細(xì)胞相比,，存在更多易被探知的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因可能為T細(xì)胞帶來(lái)選擇有利性,，這意味著轉(zhuǎn)基因表達(dá)使造血祖細(xì)胞選擇性存活生長(zhǎng),，并且可能分化為不同優(yōu)勢(shì)的淋巴祖細(xì)胞。這也是強(qiáng)調(diào)了腺苷脫氨酶在淋巴細(xì)胞分化中的重要作用,，而它在髓細(xì)胞生長(zhǎng)中作用不大,。為探測(cè)存活生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，必須有三個(gè)條件：轉(zhuǎn)基因表達(dá)使轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞存活生長(zhǎng),；轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞在最終分化為大量具有功能的正常細(xì)胞前必須經(jīng)歷幾次分裂,；最終的分化細(xì)胞應(yīng)是長(zhǎng)期細(xì)胞，例如T細(xì)胞,。在這一研究中,，ADA基因在其它的T細(xì)胞中是不表達(dá)的，用PEG-ADA阻斷酶增加,，減少T細(xì)胞數(shù)目和免疫性,。ADA轉(zhuǎn)基因表達(dá)不能恢復(fù)淋巴細(xì)胞生成。
十年后,，回顧過(guò)去,，ADA缺陷癥并不是作為研究基因治療的最佳模型。PEG-ADA治療很可能消除了轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞祖先選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì),，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞能夠存在并增殖,。最近的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象證實(shí)了這一假設(shè)，將ADA基因轉(zhuǎn)入一位病人的外周血液淋巴細(xì)胞中后,，停止PEG-ADA治療,，可觀察到T細(xì)胞數(shù)量增加和其功能。另一阻礙是因?yàn)锳DA缺陷對(duì)出生的小鼠是致命的,，無(wú)法造模,，直到最近采用基因工程手段后才有ADA缺陷鼠模型的出現(xiàn)。此外,，ADA缺陷對(duì)肝臟,、肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)都是有害的。現(xiàn)在仍不清楚是否正常ADA基因轉(zhuǎn)入淋巴祖細(xì)胞后能消除疾病的代謝障礙,。
吞噬細(xì)胞紊亂的基因治療
編碼與吞噬細(xì)胞（粒細(xì)胞,、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）功能相關(guān)的基因突變,，可導(dǎo)致人體免疫缺陷,。β2整合素蛋白若基因表達(dá)活性或蛋白功能受損，粒細(xì)胞便不能遷移進(jìn)入組織,。如此病人便容易受到細(xì)菌感染,。白細(xì)胞黏附缺陷病（LAD）即為一例,。NADPH氧化酶復(fù)合體可以運(yùn)輸氧自由基進(jìn)入吞噬體幫助吞噬微生物,，若NADPH氧化酶復(fù)合體缺失，則對(duì)細(xì)菌和真菌易感,，會(huì)產(chǎn)生慢性肉芽腫?。–GD），這種病主要是編碼細(xì)胞色素b的 α,、β亞基（P22PHOX,，GP91PHOX）和兩個(gè)細(xì)胞因子（中性細(xì)胞因子1/P47PHOX和中性細(xì)胞因子2/P67PHOX）的四個(gè)基因發(fā)生了突變。人們希望把正確的基因轉(zhuǎn)入造血祖細(xì)胞來(lái)治療這些重癥,。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,，轉(zhuǎn)基因已在鼠模型身上取得成功。然而,，在臨床實(shí)驗(yàn)中,，在體內(nèi)將正確基因轉(zhuǎn)入，經(jīng)CD34細(xì)胞表面陽(yáng)性選擇并由骨髓遷移進(jìn)入血液的造血祖細(xì)胞,，數(shù)量不足2%,。多次注射轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞也不能增加數(shù)目,。但未檢測(cè)到免疫反應(yīng)抵觸轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，說(shuō)明不是這種原因?qū)е罗D(zhuǎn)基因如此低效,。這些實(shí)驗(yàn)采用了目前最先進(jìn)的技術(shù),，包括高滴度的逆轉(zhuǎn)錄病毒；假GALV被膜病毒模型機(jī)制,，這一機(jī)制可增加靶細(xì)胞感染機(jī)率,；細(xì)胞因子的使用，可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞分裂,；纖蛋白片段CH-296參與的轉(zhuǎn)導(dǎo),，可增加轉(zhuǎn)導(dǎo)率。盡管有這些先進(jìn)技術(shù),，基因轉(zhuǎn)入人體造血干細(xì)胞的效率仍十分有限,。缺少選擇有利性，如果只有很少的干細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo),，那么其檢測(cè)率也將會(huì)很低,。
根據(jù)我們的觀點(diǎn)，這些遺傳性吞噬細(xì)胞紊亂病也不適于進(jìn)行基因治療,。由于β2整合素和NADPH氧化酶復(fù)合體只在分化了的細(xì)胞里有功能,，因此不可能提供存活優(yōu)勢(shì)或生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。而且,，粒細(xì)胞半衰期很短（大約2天）,，因此轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞只能在外周存活很短時(shí)間。轉(zhuǎn)基因是否成功取決于分化細(xì)胞的存活,，增殖和壽命,。
X染色體遺傳的SCID（SCID-X）的基因治療
SCID疾病的特征是T細(xì)胞發(fā)育缺陷（有或無(wú)自然殺傷細(xì)胞）。這些缺陷是由于信號(hào)下游受體如γc（其為IL-2,、LI-4,、IL-7、IL-9,、IL-11,、IL-15和IL-21的受體）的缺損引起的。特有細(xì)胞因子于受體結(jié)合通?？杉せ頙anus激酶（JAKs）,，然后，JAKs磷酸化胞內(nèi)底物,，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子：STAT蛋白,。STAT蛋白定位核內(nèi)控制下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SCID癥（SCID-X）的發(fā)生是由于JAK3絲氨酸蛋白激酶基因缺失,，該激酶能與γc細(xì)胞因子的尾部結(jié)合,，該基因缺失后使得γc細(xì)胞因子受體亞基不能表達(dá)或以非功能形式表達(dá),；或 IL-7受體A鏈（IL-7RA）不表達(dá)也導(dǎo)致SCID癥。在后一種情形中,，IL-7受體A鏈不能表達(dá),，在T細(xì)胞受體β基因重排前，IL-7不能傳遞存活,、增殖信號(hào)使T細(xì)胞祖細(xì)胞擴(kuò)增。表達(dá)γc,、JAK3,、IL-7RA蛋白的淋巴祖細(xì)胞比未經(jīng)校正的細(xì)胞有明顯生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)橹辽僭谑篌w內(nèi),，在發(fā)育階段T細(xì)胞祖細(xì)胞的擴(kuò)增是大規(guī)模進(jìn)行的,。
兩組試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持了這一假設(shè)。一是,，我們觀察到通過(guò) "天然"的基因治療,，一位SCID-X患者的免疫缺陷部分地被糾正。在他的血液中,，正常的T細(xì)胞很少（換句話說(shuō)就是表達(dá)功能γc蛋白的T細(xì)胞很少）,，同時(shí)，其它細(xì)胞仍然攜帶突變的γc基因,。這一發(fā)現(xiàn)只有一種解釋,，T細(xì)胞祖細(xì)胞自發(fā)發(fā)生回復(fù)突變，因此糾正了突變的γc基因,。從TCRVβ-Jβ使用頻率和CDR3編碼序列顯示這一例子中T細(xì)胞含有大約1%完整的TCRVβ,。這些T細(xì)胞在兩年內(nèi)均能檢測(cè)到。因此,，在基因回復(fù)突變和TCRβ基因重排之間T細(xì)胞至少進(jìn)行了10至11次分裂,。也體現(xiàn)出T細(xì)胞祖細(xì)胞令人驚訝的增殖能力。二是,，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將JAK3基因轉(zhuǎn)入JAK3-1-鼠造血干細(xì)胞（HSCs）中獲得免疫缺陷糾正,。有趣的是，雖然T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)概率為100%,，外周髓細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率卻很低,。與此同時(shí)，作為臨床試驗(yàn)的前提,，γc基因必須成功的轉(zhuǎn)入γc基因缺陷鼠的造血干細(xì)胞(HSCs)中（圖3）,。使用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，能在體外糾正γc在B細(xì)胞,、T細(xì)胞,、自然殺傷性細(xì)胞祖細(xì)胞的表達(dá)和‰功能,。
1999年開(kāi)始第一例SCID-X基因治療臨床試驗(yàn)。病人按以下標(biāo)準(zhǔn)招募：確診為SCID-X,，缺乏同型HLA的捐贈(zèng),，以及知情同意。方案依據(jù)富含CD34的骼脊骨髓細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo),。這一試驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)證實(shí)選擇有利性概念的正確,。如果我們進(jìn)一步觀察病人達(dá)一年多時(shí)間，5例病人中的4例,，與轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+細(xì)胞融合的淋巴細(xì)胞,，在6-12周內(nèi)，就細(xì)胞數(shù)目,、數(shù)量分配,、TCR多樣性和捕獲抗原活性而言，外周轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞與相同年齡對(duì)照組有相似的特征,。胸腺產(chǎn)生的新生T細(xì)胞可以被檢測(cè)到,。至今，改正T細(xì)胞免疫缺陷已平均維持在3.3年,。雖然B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率低,，至少有一部分免疫球蛋白產(chǎn)物被保留。在這些病人身上免疫缺陷的糾正足夠阻止臨床SCID癥狀,，例如,，防止長(zhǎng)期腹瀉；此外,，孩子受感染后表現(xiàn)出正常的反應(yīng),。至今這4個(gè)孩子享受著正常生活。通過(guò)定量PCR分析和免疫熒光檢測(cè),，所有在孩子血液中檢測(cè)到的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞都攜帶并表達(dá)γc轉(zhuǎn)基因,，與此同時(shí)，只有不超過(guò)0.1-1%的骨髓細(xì)胞和1-5%的B細(xì)胞表達(dá)γc轉(zhuǎn)基因,。因此,，我們使用一種相似的轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)人體CD34+細(xì)胞應(yīng)用于基因治療SCID-X癥，盡管事實(shí)上它對(duì)慢性肉芽腫?。–GD）和白細(xì)胞黏附缺陷?。↙AD）無(wú)任何作用。有趣的是,，一些轉(zhuǎn)導(dǎo)的骨髓前體細(xì)胞兩年后都能檢測(cè)到,。這一現(xiàn)象表明某些轉(zhuǎn)導(dǎo)的多潛能祖先在這些孩子們骨髓中存留。加上T細(xì)胞的長(zhǎng)壽命,，這一發(fā)現(xiàn)增加了我們對(duì)糾正免疫缺陷穩(wěn)定性的希望,。不過(guò),，γc基因沉默或者前體缺損就令人不太樂(lè)觀。
基因治療SCID癥的未來(lái)
這些試驗(yàn)結(jié)果為基因治療的潛能提供了證據(jù),，實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞被賦予了選擇優(yōu)勢(shì),。研究尚需大量病人范例以精確評(píng)估其治療潛力。研究還擴(kuò)展到其他免疫缺陷治療或者造血干系統(tǒng)基因缺損的治療,。
遺留問(wèn)題：
我們需要多少轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞,？
這一問(wèn)題的答案由在動(dòng)物模型進(jìn)行一定數(shù)量未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)的結(jié)果決定。同時(shí)根據(jù)在回復(fù)突變株上的觀察結(jié)果,，一個(gè)T細(xì)胞前體大約能保留～1% T細(xì)胞,。如果我們按線形函數(shù)計(jì)算結(jié)果，只要提供幾百個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞就足夠維持至少幾年之內(nèi)所有的T細(xì)胞正常,。果真如此,，由于T細(xì)胞發(fā)育缺損引起的其他T細(xì)胞免疫缺陷癥就有望用基因治療進(jìn)行糾正,。
自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)育的情況如何,？
在SCID-X基因治療試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn),，雖然能監(jiān)測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞,，但它們的數(shù)目相當(dāng)?shù)汀＿@是與接受同種異型干細(xì)胞移植的SCID患者相比較而得出的,。其中原因仍不清楚,，我們還在分析是否是由于自然殺傷細(xì)胞分裂或存活的局限性引起的。在SCID-X病人的CD34+細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入γc基因,，發(fā)現(xiàn)循環(huán)B細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞數(shù)目的比例比轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞要少得多,。這可能是與未轉(zhuǎn)導(dǎo)B細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)空間位置的結(jié)果造成。另外,，也可能是由于B細(xì)胞前體增殖力太低,，或是與T細(xì)胞相比，表達(dá)γc B細(xì)胞的選擇優(yōu)勢(shì)較弱,。對(duì)于B細(xì)胞缺陷引起的SCID癥治療,，例如，重組激活基因（RAG1/RAG2）或Artemis缺陷,，我們想知道轉(zhuǎn)基因入CD34+細(xì)胞糾正B細(xì)胞免疫缺陷的可行性有多大,。
轉(zhuǎn)基因的最佳目標(biāo)是什么？
治療遺傳性淋巴細(xì)胞缺陷,，有效地將基因轉(zhuǎn)入自我更新的造血干細(xì)胞是顯著的解決方法,。然而，目前我們臨床上應(yīng)用的載體系統(tǒng)還不能穿過(guò)干細(xì)胞的核膜,。干細(xì)胞大部分是不進(jìn)行分裂的,，其結(jié)構(gòu)完整的膜構(gòu)成轉(zhuǎn)基因的屏障,。就SCID病人而言，假如潛在的一小部分轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞有效力,，那么就有可能使少數(shù)分裂的干細(xì)胞能被轉(zhuǎn)導(dǎo),，最終治愈疾病。這樂(lè)觀的假設(shè)可以通過(guò)測(cè)試檢驗(yàn)：長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的存在與否,。在鼠體內(nèi),，不同環(huán)境下CLPs引起不同淋巴細(xì)胞血系，這一觀點(diǎn)已被普遍接受,。如果人體淋巴細(xì)胞系分化通道存在CLPs,，將是淋巴系統(tǒng)特異性基因治療的誘人靶目標(biāo)，因?yàn)榭杀苊廪D(zhuǎn)基因在骨髓細(xì)胞表達(dá),。由于CLPs的確潛在表達(dá)可供選擇的標(biāo)記,，此方案就存在可行性。關(guān)鍵在于這種細(xì)胞的壽命,，在小鼠體內(nèi),，它們不具有自我更新的能力。
那些疾病可以作為基因治療,？
如果缺陷基因的野生型能賦予轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞祖先選擇優(yōu)勢(shì),，就有可能進(jìn)行基因治療，應(yīng)用于各種SCID癥狀（圖1）,。首先,，JAK3和IL-7 Rα缺陷具有相同機(jī)制，都是SCID-X,，可進(jìn)行基因治療,。基因回復(fù)能部分糾正ADA缺陷表型,，說(shuō)明ADA缺陷同樣可作基因治療,，即使不用PEG-ADA進(jìn)行輔助治療。胸腺細(xì)胞發(fā)育時(shí),，缺少V（D）J重排,，會(huì)導(dǎo)致胸腺細(xì)胞在γc依賴細(xì)胞增殖階段死亡。如果TCR（或B細(xì)胞受體）重排后細(xì)胞存活,，淋巴祖細(xì)胞RAG1,、RAG2、Artemis的誘導(dǎo)表達(dá)可間接提供預(yù)期的選擇優(yōu)勢(shì),，此推測(cè)若實(shí)現(xiàn)極為誘人,。轉(zhuǎn)基因的持續(xù)表達(dá)，至少RAG1、RAG2,，對(duì)成熟T細(xì)胞,、B細(xì)胞而言，是非必需的,，這使得基因治療更為吸引人,。我們尚需試驗(yàn)證明這一假設(shè)。T細(xì)胞發(fā)育受阻越遲,，轉(zhuǎn)基因?qū)е耇細(xì)胞前體存活發(fā)育的可能性就越小,。然而，最近觀察到一例患有Wistott-Aldrich綜合癥（WAS）的成年人部分糾正了T細(xì)胞免疫缺陷,，這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了這一概念,。這位病人免疫缺陷狀況的顯著改進(jìn)，使得基因治療WAS癥成為可能,。WAS是由于編碼WASP蛋白的基因突變引起,，該基因?yàn)楣芗一颍渚幋a蛋白參與造血細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白-細(xì)胞骨架重排,。WAS病人淋巴細(xì)胞正常發(fā)育,，而T細(xì)胞的激活、遷移,、存活卻受到損傷,。WASP基因回復(fù)突變意義重大,，這也第一次證明通過(guò)T細(xì)胞前體的基因糾正,，外周T細(xì)胞，至少部分外周T細(xì)胞缺陷能被克服,?；蛑委熤饕拿庖呷毕莶〉姆秶鷮U(kuò)大。
如何促進(jìn)轉(zhuǎn)基因,？
載體的局限性,，就穿越核膜而言，阻礙了基因治療進(jìn)一步應(yīng)用,。然而,，我們有兩條途徑可遵循。第一是,，給轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞一陽(yáng)性選擇壓力,。轉(zhuǎn)入第二個(gè)編碼選擇標(biāo)記的基因，例如,，抗藥產(chǎn)物（多抗病性,，MDR1；二氫葉酸還原酶，DHFR）或膜蛋白（IL-2受體α鏈,，CD24）,，能促進(jìn)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞富集，應(yīng)用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）元件載體,，可以獨(dú)立從普通mRNA開(kāi)始翻譯,。初步試驗(yàn)證明了這一可行性，但體內(nèi)效用的證明還有待期待,。
另一途徑是改進(jìn)轉(zhuǎn)基因入HSCs的技術(shù),。這件重要任務(wù)需要大量工作。包括使用病毒的衣殼,，例如來(lái)源于貓?bào)w內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄病毒RD11的衣殼,，能與HSCs表達(dá)的特異性受體以較高親和力結(jié)合；以慢病毒載體為介質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)未分裂細(xì)胞,；或者刪除阻礙序列防止基因沉默,。的確，慢病毒的前整合復(fù)合物,，比如HIV-1能進(jìn)入核膜而有效整合,。這一特征的成功應(yīng)用表明人體造血干細(xì)胞可有效被轉(zhuǎn)導(dǎo)。如果,，解決了HIV來(lái)源載體引起的安全問(wèn)題,，那么這一領(lǐng)域中這種載體的應(yīng)用會(huì)得到重點(diǎn)發(fā)展。聯(lián)合限制性家族表達(dá)一起使用,，如血紅蛋白在類紅細(xì)胞中表達(dá),，此技術(shù)體現(xiàn)了治療更多基因紊亂癥的可行性。
分析已有成功經(jīng)驗(yàn),，展望未來(lái)發(fā)展,，我們可得出相同結(jié)論，有效的基因治療不僅需要對(duì)疾病機(jī)制有深入了解,，而且還需要發(fā)展最新可采用的技術(shù),。設(shè)計(jì)出能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂干細(xì)胞的載體，是我們的期待,。
其他證據(jù)
最近,，Aintietal報(bào)導(dǎo)，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體轉(zhuǎn)基因入ADA缺陷病人的骨髓祖細(xì)胞,，同時(shí)無(wú)需酶輔助治療,，便能持久有意義地糾正由ADA缺陷引起的免疫缺陷癥。這些結(jié)果肯定了選擇優(yōu)勢(shì)概念可有效地應(yīng)用于基因治療,。
附錄：
圖一：T細(xì)胞發(fā)育缺陷導(dǎo)致重癥聯(lián)合型免疫缺陷綜合癥（SCID）
在胸腺中T細(xì)胞從T細(xì)胞前體,，經(jīng)過(guò)不同發(fā)育階段最終成為成熟的T細(xì)胞，包括V（D）J重組，前T細(xì)胞受體（pre-TCR）表達(dá),、誘導(dǎo)擴(kuò)增和TCR引起的陽(yáng)性陰性選擇,。T細(xì)胞分化需要很多因素，一般有細(xì)胞因子受體γ鏈（γc）,、JAK3,、LI-7受體α鏈（IL-7Rα）、腺苷脫氨酶（ADA）,、重組-激活基因1（RAG1）和RAG2,、Artemis、CD3ε,、CD3γ,、CD45、ζ鏈相關(guān)蛋白,、ZAP70,。編碼這些蛋白的基因發(fā)生突變會(huì)導(dǎo)致SCID或T細(xì)胞缺陷，根據(jù)病理生理學(xué)分為四組,。（圖中四個(gè)藍(lán)框表示）,。圖示蛋白質(zhì)在不同階段的功能，ADA缺陷階段產(chǎn)生的T細(xì)胞基因損傷具有高度隨機(jī)性,。簡(jiǎn)便起見(jiàn),，TCRγδT細(xì)胞發(fā)育和CD4+、CD8+T細(xì)胞分化未顯示,。
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圖二：含有γ鏈細(xì)胞因子受體圖解
含有γ鏈的細(xì)胞因子受體損傷或缺失導(dǎo)致下游信號(hào)傳導(dǎo)受阻引起SCID病,。γ鏈?zhǔn)荌L-2、IL-4,、IL-7,、IL-9,、IL-15和IL-21受體的組成成分,。其中，IL-2R,、IL-15R有三個(gè)亞基：α,、β、γ,；IL-4R,、IL-7R、IL-9R和IL-21R由α,、γ亞基組成,。若沒(méi)有γ鏈，正常信號(hào)傳導(dǎo)途徑--JAKs激活、信號(hào)使者磷酸化,、STAT蛋白激活,，受阻。至今研究確定SCID的起因包括γ鏈損傷和表達(dá)的γ鏈無(wú)功能,、表達(dá)的JAK蛋白無(wú)功能（不能被激活去磷酸化STAT分子）或者是IL-7Rα鏈缺陷,。簡(jiǎn)單起見(jiàn)，圖示的受體為兩個(gè)亞基組成（如IL-7R）,。
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圖三：SCID-X疾病體內(nèi)基因治療的原理
CD34+細(xì)胞與攜帶編碼細(xì)胞因子受體γ鏈基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清孵育,。病毒攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞。病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA,，作為前整合體復(fù)合物,，與細(xì)胞基因組重組。在病毒LTR的控制下,，γ鏈基因可被轉(zhuǎn)錄合成蛋白質(zhì),，在細(xì)胞膜表達(dá)和發(fā)揮作用。mRNA,，信使RNA,。
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圖四：SCID-X基因治療試驗(yàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程圖示
收集病人的骨髓，選出CD34+細(xì)胞,。將這些細(xì)胞與提供存活和增殖信號(hào)的細(xì)胞因子一起孵育,，然后轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（一天一個(gè)周期，3天）,。把細(xì)胞置于包被有CH-296的袋中,，有利于病毒-細(xì)胞相互作用。經(jīng)過(guò)四天完成程序,，篩選出細(xì)胞注射回到病人的靜脈中,，無(wú)需其他輔助治療。FACA,，熒光激活細(xì)胞分選儀,；FLT3L，F(xiàn)LT3配體,；IL-3,，白介素3；MFG,，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,；MGDF，巨核細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育因子,；SCF,，干細(xì)胞因子,。
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Box1：逆轉(zhuǎn)錄載體特征
小鼠致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA）
進(jìn)入人體與造血祖細(xì)胞結(jié)合
原病毒整合入基因組分化細(xì)胞
隨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)基因復(fù)制
在病毒LTR或內(nèi)源啟動(dòng)子的控制下轉(zhuǎn)基因表達(dá)
病毒顆粒不復(fù)制
無(wú)病毒蛋白表達(dá)
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Box2：基因治療ADA缺陷的教訓(xùn)
轉(zhuǎn)導(dǎo)的大量T細(xì)胞沒(méi)有負(fù)作用
需要在動(dòng)物模型上進(jìn)行臨床前試驗(yàn)
轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的壽命
轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞沒(méi)有選擇優(yōu)勢(shì)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不能產(chǎn)生足夠的高水平糾正
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Box3：SCID-X基因治療成果
好處：各種T細(xì)胞發(fā)育
持久的T細(xì)胞缺陷糾正（長(zhǎng)達(dá)三年）
T細(xì)胞多整合位點(diǎn),，表明T細(xì)胞有多克隆來(lái)源
病人沒(méi)有隨機(jī)感染的現(xiàn)象
局限：自然殺傷細(xì)胞數(shù)目很少（同源異型在造血干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后可見(jiàn)）
轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞比例少（雖然產(chǎn)生抗體反應(yīng)）
長(zhǎng)期結(jié)果還未知（潛在的基因沉默效應(yīng)或轉(zhuǎn)導(dǎo)前體的耗竭）
