邵焰 譯

韓國生命科學院

簡介：LAT最初從活化的Jurkat細胞系細胞膜中純化到的一種與T細胞活化有關(guān)的蛋白質(zhì),，主要表達于T,，NK，血小板和肥大細胞,，B細胞和單核細胞不表達,。LAT是一種I型膜本體蛋白（integral membrane protein）,包括較短的N端胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和較長的胞漿區(qū),。LAT末端有四個酪氨酸殘基（Y132,，Y171，Y191,，Y226）是活性必須的.一個可募集磷脂酶Cγ1 （PLCγ-1）的YXXV基序,，三個可募集Grb2,、Grap和Gads的YXN基序?？缒^(qū)附近兩個半胱氨酸（Cys26和Cys29）是棕櫚?；奈稽c，使LAT成為脂筏（GEM,，raft）結(jié)構(gòu)中的一個重要分子,。在TCR參與下，LAT末端酪氨酸磷酸化,，招募大量對T細胞激活重要的信號分子,。磷酸化的LAT結(jié)合三個接頭蛋白：Gads 、PLCγ-1,、Grb2,。1）Gads和SLP-76結(jié)合到LAT復合體上，使SLP-76磷酸化,。磷酸化的SLP-76結(jié)合NcK\Vac對T細胞的肌動蛋白的聚合和帽的形成起重要的調(diào)節(jié)作用,。2）Grb2吸引Sos到LAT復合體上，介導Ras-Raf-MAPK途徑,。3）PLCγ-1和LAT結(jié)合導致磷酸化和脂酶招募GEM（糖脂富含的細胞膜區(qū)）激活鄰近PI4,，5P2活化的磷脂酶。PLCγ-1水解PI4,，5P2 生成第二信使Ins1,4,5P3和1,，2DAG，從而Ca+移動和PKC的活化,。以上三種途徑在各種水平上相互關(guān)聯(lián),，促進NFAT，AP-1和NFκB轉(zhuǎn)錄活性的激活,，導致IL-2 基因的轉(zhuǎn)錄,。

LAT（T細胞活化連接子）點突變鼠雜合子早期阻斷T細胞突變但后來發(fā)展為在多克隆淋巴增殖性紊亂和終身免疫疾病征。來自LAT變異鼠的T細胞內(nèi),，T細胞受體（TCR）誘導的PLCγ-1和NFAT激活,，Ca+內(nèi)流，IL-2產(chǎn)生以及細胞死亡都減弱或消失,。相反,，TCR誘導的Erk激活完整無缺。這些結(jié)果證實,，在T細胞發(fā)育穩(wěn)態(tài)中,，LAT對PLC-γ1 and Ras-Erk信號完整起關(guān)鍵作用。

LAT是一種跨膜支架蛋白,。TCR參與后,，酪氨酸磷酸化募集大量用于T細胞激活的信號分子,。末端四個酪氨酸殘基（Y132，Y171,，Y191，Y226）是活性必須的.這四個的酪氨酸殘基突變將TCR從PLCγ-1-鈣和Ras-Erk信號途徑分開,，引起T細胞發(fā)育的完全中斷（3-6）,。LAT酪氨酸殘基優(yōu)先選擇特殊的效應(yīng)蛋白（3-6）。LAT酪氨酸132殘基選擇性結(jié)合PLCγ-1,。表達Y132F（Tyr132突變?yōu)镻he）突變蛋白的T細胞株降低了PLCγ-1的磷酸化,，減弱或缺乏鈣內(nèi)流（3-5）。當TCR參與后這個突變減弱NFAT活性,，也阻斷Erk磷酸化（3-5）,，提示PLCγ-1在T細胞的Ras激活中也許通過Ras-GRP（一個DAG依賴的鳥嘌呤交換因子）起作用（7）。

單個LAT酪氨酸對T細胞發(fā)育和功能的重要性被knock in LAT突變所檢驗,，這個在knock in鼠突變等同于人Tyr132（稱為Tyr136）突變成苯丙氨酸稱為LATY136F (Fig. 1A),。來源于胚胎干細胞的兩個獨立的克隆被用來建立純合子突變株來顯示相近的表現(xiàn)型。末尾DNA測序證實的LATY136F突變株和在目的等位基因的剩余的編碼序列,。來自純合子LATY136F突變鼠的LAT表達在胸腺T細胞約為細胞的一半,。相似的誘導表達在LAT+/-（雜合子）和LATWT/WTknock in鼠（表達LAT野生型的knock in模型）。兩者在T細胞發(fā)育和功能上表現(xiàn)為沒有損傷,。

分析來自2周LATY136Fm/m鼠揭示嚴重的但不是完全阻斷T細胞發(fā)育,。來自LATY136m/m鼠的胸腺較小，約為LAT+/+的5~10%,。相對于LAT+/+同窩出生鼠含有高百分比的CD4-CD8-胸腺細胞,。另外，在LATY136Fm/m,中間狀態(tài)CD4+CD8+胸腺細胞和成熟的CD4+和CD8+細胞的數(shù)目和百分比都明顯減少(Fig. 1A and fig. S2) (8).,。檢查LATY136Fm/m成熟的CD4-CD8-胸腺細胞亞群揭示T細胞發(fā)育阻斷在CD25+CD44lo/-階段(Fig. 1A).,。因為前TCR信號是CD25+CD44lo/-細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D25-CD44l-階段所要求的，這些結(jié)果暗示LATY136F突變株依賴前TCR復合物,。

人們觀察到老的LATY136Fm/m是一個完全不同的原形,。約四周齡時，LATY136Fm/m鼠開始顯示胸腺病變和脾腫大（fig.S3）(,。淋巴結(jié)和脾包含原始的CD4+T細胞和數(shù)量增加的B細胞,、巨噬細胞和嗜酸性細胞(Fig1B)(9)。來自較老的LATY136Fm/m鼠胸腺較小,，也包含高百分比的CD4+ T細胞和的B細胞,，這提示它們已經(jīng)被來自外周淋巴結(jié)的細胞所滲透。組化分析顯示CD4+T細胞,、B細胞,、巨噬細胞和嗜酸性細胞多器官滲透（fig.S3）(9),。大多數(shù)LATY136Fm/m鼠在六周齡前死去。

由于幼小的LATY136Fm/m鼠有小胸腺和微量成熟的CD4+和CD8+胸腺細胞和T細胞,，來自較老的LATY136Fm/m鼠的外周淋巴器官有大量CD4+T細胞的發(fā)現(xiàn)暗示這些細胞因繁殖擴張而增加,。事實上，來自LATY136Fm/m鼠的CD4+T細胞比LAT+/+的大而且表現(xiàn)為前激活的表現(xiàn)型CD62LloCD45RBloCD44hi(fig.S2)(8). LATY136Fm/m鼠比LAT+/+包含更高百分比的繁殖性的T細胞（Fig1B）,。外周CD4+T細胞的TCR的全部展示是多樣的（用TCRβ方法檢測）,，這暗示多克隆擴增（9）。來自LATY136Fm/m鼠的CD4+T細胞也抗TCR介導的細胞死亡（Fig1B和figS4）,這暗示另一種細胞擴張的可能機制,。
來自LATY136Fm/m鼠的T細胞表達低水平的表面TCR（Fig1B）,。體外培養(yǎng)數(shù)天后，盡管沒有達到正常水平,，TCR表達增加,。除了低表達TCR外，LATY136Fm/mT細胞是CD5 hi（figS2）（8）,，這是細胞表達高親合自身配體的TCR的特性（12）,，胸腺發(fā)育異常和相伴隨的資料（Fig1A）暗示LATY136Fm/m胸腺選擇受損導致自身反應(yīng)的T細胞存活。

來自LATY136Fm/m鼠的CD4+細胞體外繁殖對CD3抗體低應(yīng)答,，甚至存在C28單抗的共刺激時也如此,，相反，它們對PMA和ionomycin或抗CD3和抗CD28抗體加ionomycin應(yīng)答與LAT+/+T細胞的相似,。事實上,，ionomycin足夠誘導LATY136Fm/m鼠在存在其他刺激時繁殖T細胞（Fig2A）。來自的T細胞也對IL2加TCR刺激應(yīng)答而繁殖（Fig2A）,。因此,，LAT136Fm/m鼠的T細胞的體內(nèi)激活，出現(xiàn)信號途徑缺陷,，它們有能力產(chǎn)生IL-2對TCR的加入應(yīng)答,。

為了調(diào)查LATY136Fm/m鼠的發(fā)育和功能異常的分子基礎(chǔ)，我們做了一項TCR信號應(yīng)答的分析,。CD4+淋巴結(jié)T細胞純化后用抗CD3和抗CD28抗體共刺激,，在LAT136Fm/m鼠的T細胞，那些不依賴LAT磷酸化的（如TCRζ和ZAP-70的酪氨酸磷酸化）近端激活不受影響（Fig3A）,。另外,，酪氨酸磷酸化的配體蛋白SLP-76結(jié)合LAT酪氨酸（而不是通過它與配體Grads結(jié)合Y136）不受損（9）?？贵w刺激后LAT136Fm/m鼠的LAT和PLC-γ1的磷酸化明顯減少（Fig3A）,。CD4+淋巴結(jié)T細胞和胸腺細胞不能應(yīng)答CD3加CD4或CD3加交聯(lián)而動員鈣離子，甚至用高濃度的刺激性的抗體孵育時也如此（Fig3B）,。CD4+ CD8+胸腺細胞的TCR誘導的鈣內(nèi)流也流產(chǎn)或減弱（Fig3B）,，它們的TCR表達水平與LAT+/+鼠的相似（9）,。TCR交聯(lián)也不能激活鈣依賴的NFAT-c2（figS5）或誘導IL-2產(chǎn)生（Fig2B）。IL-2在TCR加入后增加FasL表達和使細胞對Fas介導的殺傷敏感（14,，15）,。在體外激活前后，LAT136Fm/m鼠T細胞比來自LAT+/+鼠的T細胞低表面水平表達Fas,，而且不能誘導應(yīng)答TCR參與的Fas表達（figS4）,。與這一致，LAT136Fm/m鼠Fas介導的細胞死亡是缺陷的（figS4）,。
吃驚的是，與T細胞得到的結(jié)論相反,，來自LAT136Fm/m鼠的CD4+T細胞和CD4+ CD8+胸腺細胞的Erk激活應(yīng)答CD3加CD4交聯(lián)是正?；蜉p微的減少（Fig3A）。另外,，CD3單抗對來自LAT136Fm/m鼠的CD4+ CD8+胸腺細胞的刺激減弱了CD5表達,。這個應(yīng)答已經(jīng)顯示是Ras依賴的（16，17）,。這些結(jié)果提示LAT136F敲入突變鼠把TCR信號與PLCγ-1-鈣依賴的信號分離但不阻斷體內(nèi)Ras-Erk依賴途徑的激活,。

LATY136Fm/m表型與缺乏 NF-ATc1 and NF-ATc2的鼠有驚人的類似之處。這暗示它促使至少部分地不能激活這些轉(zhuǎn)錄因子,。在NF-ATc1 / NF-ATc2 / 鼠的CD4+T細胞被激活,，T輔助細胞偏倚，以及分泌大量IL-4細胞,。為了確定來自LATY136Fm/m的CD4+T細胞是否有TH2細胞因子偏倚,，我們分析刺激后細胞的IL-4 和IFN-γ。anti-CD3 plus anti-CD28抗體刺激后來自LATY136Fm/m鼠的T細胞產(chǎn)生很低水平的細胞因子,。然而PMA和ionomycin刺激后TCR信號旁路使來自LATY136Fm/m的CD4+T細胞產(chǎn)生比knock-in雜合子或 LAT+/+ mice相對多的IL-4 (Fig. 2B). 與TH2細胞因子一致,， LATY136Fm/m鼠的IgG1、E,、M血清濃度升高,，還有包含大量嗜酸性細胞的多器官滲透（9）。最后,，LATY136Fm/m鼠也可以提高DNA和核抗原自身抗體血清水平(fig. S6),。

LAT上的一些特定位點的突變的體內(nèi)效應(yīng)揭示了在早期T細胞的發(fā)育中PLCr1-Ca信號傳導系統(tǒng)的作用。鈣的信號對于胸腺中陰性選擇的確立是很重要的（19,，20）,。因此在LATY136Fm/m鼠中正常情況下被陰性選擇除去的胸腺細胞可以存活下來并轉(zhuǎn)移到胸腺外周。這些細胞不同于正常的T細胞必須PLC-γ1激活Ras-Erk,。在這個觀點中,，值得注意的是PLC-r1-DAG獨立地激活Ras已經(jīng)在外周血來源的T細胞中被描述了,，而且LAT132YF突變的蛋白保留TCR激活后募集Grb2與Ras鳥氨酸交換因子Sos的能力。在LATY136Fm/mT細胞中PLC-γ1低水平的催化就可以足夠的激活Ras-GRP或者是蛋白激酶C,從而導致了Ras-Erk的激活,。在LATY136Fm/m鼠中由PLC-γ1介導的信號選擇性丟失而非Erk信號所導致的T細胞平衡態(tài)的破壞進一步表明了對于LAT在結(jié)合TCR下游信號中具有重大的作用,。