邵焰 譯

韓國生命科學(xué)院

簡介：LAT最初從活化的Jurkat細(xì)胞系細(xì)胞膜中純化到的一種與T細(xì)胞活化有關(guān)的蛋白質(zhì),，主要表達(dá)于T,，NK，血小板和肥大細(xì)胞，B細(xì)胞和單核細(xì)胞不表達(dá)。LAT是一種I型膜本體蛋白（integral membrane protein）,包括較短的N端胞膜外區(qū)、跨膜區(qū)和較長的胞漿區(qū)。LAT末端有四個酪氨酸殘基（Y132,，Y171，Y191,，Y226）是活性必須的.一個可募集磷脂酶Cγ1 （PLCγ-1）的YXXV基序,，三個可募集Grb2、Grap和Gads的YXN基序,?？缒^(qū)附近兩個半胱氨酸（Cys26和Cys29）是棕櫚酰化的位點(diǎn),，使LAT成為脂筏（GEM,，raft）結(jié)構(gòu)中的一個重要分子。在TCR參與下,，LAT末端酪氨酸磷酸化,，招募大量對T細(xì)胞激活重要的信號分子。磷酸化的LAT結(jié)合三個接頭蛋白：Gads ,、PLCγ-1,、Grb2。1）Gads和SLP-76結(jié)合到LAT復(fù)合體上,，使SLP-76磷酸化,。磷酸化的SLP-76結(jié)合NcK\Vac對T細(xì)胞的肌動蛋白的聚合和帽的形成起重要的調(diào)節(jié)作用。2）Grb2吸引Sos到LAT復(fù)合體上,，介導(dǎo)Ras-Raf-MAPK途徑,。3）PLCγ-1和LAT結(jié)合導(dǎo)致磷酸化和脂酶招募GEM（糖脂富含的細(xì)胞膜區(qū)）激活鄰近PI4，5P2活化的磷脂酶,。PLCγ-1水解PI4,，5P2 生成第二信使Ins1,4,5P3和1，2DAG,，從而Ca+移動和PKC的活化,。以上三種途徑在各種水平上相互關(guān)聯(lián)，促進(jìn)NFAT,，AP-1和NFκB轉(zhuǎn)錄活性的激活，導(dǎo)致IL-2 基因的轉(zhuǎn)錄,。

LAT（T細(xì)胞活化連接子）點(diǎn)突變鼠雜合子早期阻斷T細(xì)胞突變但后來發(fā)展為在多克隆淋巴增殖性紊亂和終身免疫疾病征,。來自LAT變異鼠的T細(xì)胞內(nèi)，T細(xì)胞受體（TCR）誘導(dǎo)的PLCγ-1和NFAT激活,，Ca+內(nèi)流,，IL-2產(chǎn)生以及細(xì)胞死亡都減弱或消失,。相反，TCR誘導(dǎo)的Erk激活完整無缺,。這些結(jié)果證實,，在T細(xì)胞發(fā)育穩(wěn)態(tài)中，LAT對PLC-γ1 and Ras-Erk信號完整起關(guān)鍵作用,。

LAT是一種跨膜支架蛋白,。TCR參與后，酪氨酸磷酸化募集大量用于T細(xì)胞激活的信號分子,。末端四個酪氨酸殘基（Y132,，Y171，Y191,，Y226）是活性必須的.這四個的酪氨酸殘基突變將TCR從PLCγ-1-鈣和Ras-Erk信號途徑分開,，引起T細(xì)胞發(fā)育的完全中斷（3-6）。LAT酪氨酸殘基優(yōu)先選擇特殊的效應(yīng)蛋白（3-6）,。LAT酪氨酸132殘基選擇性結(jié)合PLCγ-1,。表達(dá)Y132F（Tyr132突變?yōu)镻he）突變蛋白的T細(xì)胞株降低了PLCγ-1的磷酸化，減弱或缺乏鈣內(nèi)流（3-5）,。當(dāng)TCR參與后這個突變減弱NFAT活性,，也阻斷Erk磷酸化（3-5），提示PLCγ-1在T細(xì)胞的Ras激活中也許通過Ras-GRP（一個DAG依賴的鳥嘌呤交換因子）起作用（7）,。

單個LAT酪氨酸對T細(xì)胞發(fā)育和功能的重要性被knock in LAT突變所檢驗,，這個在knock in鼠突變等同于人Tyr132（稱為Tyr136）突變成苯丙氨酸稱為LATY136F (Fig. 1A)。來源于胚胎干細(xì)胞的兩個獨(dú)立的克隆被用來建立純合子突變株來顯示相近的表現(xiàn)型,。末尾DNA測序證實的LATY136F突變株和在目的等位基因的剩余的編碼序列,。來自純合子LATY136F突變鼠的LAT表達(dá)在胸腺T細(xì)胞約為細(xì)胞的一半。相似的誘導(dǎo)表達(dá)在LAT+/-（雜合子）和LATWT/WTknock in鼠（表達(dá)LAT野生型的knock in模型）,。兩者在T細(xì)胞發(fā)育和功能上表現(xiàn)為沒有損傷,。

分析來自2周LATY136Fm/m鼠揭示嚴(yán)重的但不是完全阻斷T細(xì)胞發(fā)育。來自LATY136m/m鼠的胸腺較小,，約為LAT+/+的5~10%,。相對于LAT+/+同窩出生鼠含有高百分比的CD4-CD8-胸腺細(xì)胞。另外,，在LATY136Fm/m,中間狀態(tài)CD4+CD8+胸腺細(xì)胞和成熟的CD4+和CD8+細(xì)胞的數(shù)目和百分比都明顯減少(Fig. 1A and fig. S2) (8).,。檢查LATY136Fm/m成熟的CD4-CD8-胸腺細(xì)胞亞群揭示T細(xì)胞發(fā)育阻斷在CD25+CD44lo/-階段(Fig. 1A).。因為前TCR信號是CD25+CD44lo/-細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D25-CD44l-階段所要求的,，這些結(jié)果暗示LATY136F突變株依賴前TCR復(fù)合物,。

人們觀察到老的LATY136Fm/m是一個完全不同的原形。約四周齡時，LATY136Fm/m鼠開始顯示胸腺病變和脾腫大（fig.S3）(,。淋巴結(jié)和脾包含原始的CD4+T細(xì)胞和數(shù)量增加的B細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞(Fig1B)(9)。來自較老的LATY136Fm/m鼠胸腺較小,，也包含高百分比的CD4+ T細(xì)胞和的B細(xì)胞,，這提示它們已經(jīng)被來自外周淋巴結(jié)的細(xì)胞所滲透。組化分析顯示CD4+T細(xì)胞,、B細(xì)胞,、巨噬細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞多器官滲透（fig.S3）(9)。大多數(shù)LATY136Fm/m鼠在六周齡前死去,。

由于幼小的LATY136Fm/m鼠有小胸腺和微量成熟的CD4+和CD8+胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞,，來自較老的LATY136Fm/m鼠的外周淋巴器官有大量CD4+T細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)暗示這些細(xì)胞因繁殖擴(kuò)張而增加。事實上,，來自LATY136Fm/m鼠的CD4+T細(xì)胞比LAT+/+的大而且表現(xiàn)為前激活的表現(xiàn)型CD62LloCD45RBloCD44hi(fig.S2)(8). LATY136Fm/m鼠比LAT+/+包含更高百分比的繁殖性的T細(xì)胞（Fig1B）,。外周CD4+T細(xì)胞的TCR的全部展示是多樣的（用TCRβ方法檢測），這暗示多克隆擴(kuò)增（9）,。來自LATY136Fm/m鼠的CD4+T細(xì)胞也抗TCR介導(dǎo)的細(xì)胞死亡（Fig1B和figS4）,這暗示另一種細(xì)胞擴(kuò)張的可能機(jī)制,。
來自LATY136Fm/m鼠的T細(xì)胞表達(dá)低水平的表面TCR（Fig1B）。體外培養(yǎng)數(shù)天后,，盡管沒有達(dá)到正常水平,，TCR表達(dá)增加。除了低表達(dá)TCR外,，LATY136Fm/mT細(xì)胞是CD5 hi（figS2）（8）,，這是細(xì)胞表達(dá)高親合自身配體的TCR的特性（12），胸腺發(fā)育異常和相伴隨的資料（Fig1A）暗示LATY136Fm/m胸腺選擇受損導(dǎo)致自身反應(yīng)的T細(xì)胞存活,。

來自LATY136Fm/m鼠的CD4+細(xì)胞體外繁殖對CD3抗體低應(yīng)答,，甚至存在C28單抗的共刺激時也如此，相反,，它們對PMA和ionomycin或抗CD3和抗CD28抗體加ionomycin應(yīng)答與LAT+/+T細(xì)胞的相似,。事實上，ionomycin足夠誘導(dǎo)LATY136Fm/m鼠在存在其他刺激時繁殖T細(xì)胞（Fig2A）,。來自的T細(xì)胞也對IL2加TCR刺激應(yīng)答而繁殖（Fig2A）,。因此，LAT136Fm/m鼠的T細(xì)胞的體內(nèi)激活,，出現(xiàn)信號途徑缺陷,，它們有能力產(chǎn)生IL-2對TCR的加入應(yīng)答。

為了調(diào)查LATY136Fm/m鼠的發(fā)育和功能異常的分子基礎(chǔ),，我們做了一項TCR信號應(yīng)答的分析,。CD4+淋巴結(jié)T細(xì)胞純化后用抗CD3和抗CD28抗體共刺激，在LAT136Fm/m鼠的T細(xì)胞,，那些不依賴LAT磷酸化的（如TCRζ和ZAP-70的酪氨酸磷酸化）近端激活不受影響（Fig3A）,。另外，酪氨酸磷酸化的配體蛋白SLP-76結(jié)合LAT酪氨酸（而不是通過它與配體Grads結(jié)合Y136）不受損（9）,?？贵w刺激后LAT136Fm/m鼠的LAT和PLC-γ1的磷酸化明顯減少（Fig3A）。CD4+淋巴結(jié)T細(xì)胞和胸腺細(xì)胞不能應(yīng)答CD3加CD4或CD3加交聯(lián)而動員鈣離子,，甚至用高濃度的刺激性的抗體孵育時也如此（Fig3B）,。CD4+ CD8+胸腺細(xì)胞的TCR誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流也流產(chǎn)或減弱（Fig3B），它們的TCR表達(dá)水平與LAT+/+鼠的相似（9）,。TCR交聯(lián)也不能激活鈣依賴的NFAT-c2（figS5）或誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生（Fig2B）,。IL-2在TCR加入后增加FasL表達(dá)和使細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的殺傷敏感（14，15）,。在體外激活前后,，LAT136Fm/m鼠T細(xì)胞比來自LAT+/+鼠的T細(xì)胞低表面水平表達(dá)Fas，而且不能誘導(dǎo)應(yīng)答TCR參與的Fas表達(dá)（figS4）,。與這一致,，LAT136Fm/m鼠Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡是缺陷的（figS4）。
吃驚的是,，與T細(xì)胞得到的結(jié)論相反,，來自LAT136Fm/m鼠的CD4+T細(xì)胞和CD4+ CD8+胸腺細(xì)胞的Erk激活應(yīng)答CD3加CD4交聯(lián)是正常或輕微的減少（Fig3A）,。另外,，CD3單抗對來自LAT136Fm/m鼠的CD4+ CD8+胸腺細(xì)胞的刺激減弱了CD5表達(dá)。這個應(yīng)答已經(jīng)顯示是Ras依賴的（16,，17）,。這些結(jié)果提示LAT136F敲入突變鼠把TCR信號與PLCγ-1-鈣依賴的信號分離但不阻斷體內(nèi)Ras-Erk依賴途徑的激活。

LATY136Fm/m表型與缺乏 NF-ATc1 and NF-ATc2的鼠有驚人的類似之處,。這暗示它促使至少部分地不能激活這些轉(zhuǎn)錄因子,。在NF-ATc1 / NF-ATc2 / 鼠的CD4+T細(xì)胞被激活，T輔助細(xì)胞偏倚,，以及分泌大量IL-4細(xì)胞,。為了確定來自LATY136Fm/m的CD4+T細(xì)胞是否有TH2細(xì)胞因子偏倚，我們分析刺激后細(xì)胞的IL-4 和IFN-γ,。anti-CD3 plus anti-CD28抗體刺激后來自LATY136Fm/m鼠的T細(xì)胞產(chǎn)生很低水平的細(xì)胞因子,。然而PMA和ionomycin刺激后TCR信號旁路使來自LATY136Fm/m的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生比knock-in雜合子或 LAT+/+ mice相對多的IL-4 (Fig. 2B). 與TH2細(xì)胞因子一致， LATY136Fm/m鼠的IgG1,、E,、M血清濃度升高，還有包含大量嗜酸性細(xì)胞的多器官滲透（9）。最后,，LATY136Fm/m鼠也可以提高DNA和核抗原自身抗體血清水平(fig. S6),。

LAT上的一些特定位點(diǎn)的突變的體內(nèi)效應(yīng)揭示了在早期T細(xì)胞的發(fā)育中PLCr1-Ca信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的作用。鈣的信號對于胸腺中陰性選擇的確立是很重要的（19,，20）,。因此在LATY136Fm/m鼠中正常情況下被陰性選擇除去的胸腺細(xì)胞可以存活下來并轉(zhuǎn)移到胸腺外周。這些細(xì)胞不同于正常的T細(xì)胞必須PLC-γ1激活Ras-Erk,。在這個觀點(diǎn)中,，值得注意的是PLC-r1-DAG獨(dú)立地激活Ras已經(jīng)在外周血來源的T細(xì)胞中被描述了，而且LAT132YF突變的蛋白保留TCR激活后募集Grb2與Ras鳥氨酸交換因子Sos的能力,。在LATY136Fm/mT細(xì)胞中PLC-γ1低水平的催化就可以足夠的激活Ras-GRP或者是蛋白激酶C,從而導(dǎo)致了Ras-Erk的激活,。在LATY136Fm/m鼠中由PLC-γ1介導(dǎo)的信號選擇性丟失而非Erk信號所導(dǎo)致的T細(xì)胞平衡態(tài)的破壞進(jìn)一步表明了對于LAT在結(jié)合TCR下游信號中具有重大的作用。