暨南大學(xué) 組織移植與免疫研究中心

胸腺是T淋巴細(xì)胞增殖主要的部位,。但是，直到最近才闡明了能夠執(zhí)行精確的分子間的相互作用機(jī)制,。盡管已經(jīng)分離鑒定出了許多起重要作用的分子,，這包括可溶性的因子（細(xì)胞外間質(zhì)成分和所有的膜受體以及他們的配體），但是,，這些分子在胸腺細(xì)胞分化過程中的確切作用需要進(jìn)一步詳盡的闡述,。在這一點(diǎn)上,，這里要討論的一種T細(xì)胞從干細(xì)胞中發(fā)育的簡(jiǎn)單有效的培養(yǎng)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的出現(xiàn)將會(huì)大大的簡(jiǎn)化T細(xì)胞發(fā)育過程的研究,。

眾說周知,，胸腺有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)，就是能夠?yàn)閬碓从诠撬璧淖婕?xì)胞發(fā)育成T細(xì)胞提供一個(gè)外部環(huán)境,。在缺乏胸腺的情況下（無論是先天的遺傳缺陷還是通過切除新生鼠胸腺造成的胸腺缺陷）,，都只能夠檢測(cè)到極少量的外周T細(xì)胞，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷,。所以,，很明顯胸腺為T細(xì)胞發(fā)育提供了一個(gè)適宜的環(huán)境，在這種環(huán)境下造血干細(xì)胞來源的淋巴祖細(xì)胞可以發(fā)育成為T細(xì)胞,，而且這種理論在過去的十年里已經(jīng)成為了T細(xì)胞發(fā)育的教條,。但是，胸腺到底在T細(xì)胞發(fā)育的過程中提供了什么卻不是十分清楚,。從一些簡(jiǎn)單的事實(shí)得到了一些線索,，那就是盡管T細(xì)胞和B細(xì)胞具有共同的淋巴細(xì)胞祖先，但是他們的發(fā)育的過程和在體內(nèi)的發(fā)育場(chǎng)所不同的,。B細(xì)胞是在骨髓中發(fā)育而來的,。但是對(duì)于T細(xì)胞的發(fā)育來說，淋巴祖細(xì)胞必須離開這種骨髓這種環(huán)境進(jìn)入胸腺才能夠發(fā)育成為T細(xì)胞,。更重要的是,，B細(xì)胞在體外利用骨髓來源的干細(xì)胞系很容易繁殖,。但是,，T細(xì)胞的發(fā)育需要復(fù)雜胸腺器官。許多科學(xué)家對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的胸腺依賴性已經(jīng)作出了解釋,，這些解釋引出了這樣一種概念,，即在胸腺微觀構(gòu)造中特異的基質(zhì)和上皮細(xì)胞環(huán)境為T細(xì)胞的發(fā)育提供了獨(dú)特的信號(hào)。
如圖1所示,，T細(xì)胞進(jìn)行了一系列明確的分化步驟,，這些步驟一般根據(jù)細(xì)胞表面分子CD4和CD8來劃分的：胸腺細(xì)胞始于CD4－CD8－雙陰性（DN）T細(xì)胞，接著變成CD4＋CD8＋（DP）,，最后變?yōu)槌墒斓腃D4＋或者CD8＋單陽性T細(xì)胞（SP）,。DN階段可以根據(jù)表面分子CD25和CD44的表達(dá)情況進(jìn)一步的劃分。圖1還描述出了胸腺的分區(qū),，例如皮質(zhì)區(qū)和髓質(zhì)區(qū),。最近Petrie和他的同事們的研究發(fā)現(xiàn)，通過胸腺的分區(qū)發(fā)現(xiàn),，在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中,，伴隨著胸腺細(xì)胞在胸腺不同區(qū)域中復(fù)雜的移動(dòng)過程,。淋巴祖細(xì)胞在皮髓質(zhì)交界處進(jìn)入胸腺，接著移動(dòng)到皮質(zhì)的外部,，最后返回髓質(zhì),。這個(gè)過程，包含了許多精細(xì)而又同等的選擇事件,。這個(gè)假設(shè)性的通過胸腺?gòu)?fù)雜的有指導(dǎo)性的化學(xué)運(yùn)動(dòng)已經(jīng)幫助建立起了一種觀念,，那就是T細(xì)胞的發(fā)育需要許多獨(dú)特的只有在胸腺這個(gè)整體環(huán)境下才能夠發(fā)生的相互作用。這一觀點(diǎn)進(jìn)一步得到了Anderson和他的同事們的闡明,，在胸腺中不同的STROMAL成分不能孤立,，的而只能重新聚集或者組合在一起才能組成一個(gè)支持T細(xì)胞發(fā)育的三維的空間結(jié)構(gòu)。

淋巴細(xì)胞繁殖的體外模型
受淋巴祖細(xì)胞發(fā)育成為T細(xì)胞的過程需要完整胸腺這種理論的影響,，在體外唯一能夠滿足這種要求的系統(tǒng)就是胚胎胸腺器官的培養(yǎng)系統(tǒng)（FTOC）,。這種FTOC培養(yǎng)系統(tǒng)最早是由Owen和Jenkinson在20世紀(jì)80年代提煉出來的。這種FTOC方法提供了一個(gè)孤立的可以研究T細(xì)胞發(fā)育的方法,，而且允許在其中進(jìn)行許多重要的實(shí)驗(yàn)性操作,。例如，可以預(yù)先用去鹵氧化物處理胸腺使原有的胸腺細(xì)胞消耗一空,，而且還允許利用定向的干細(xì)胞或者淋巴祖細(xì)胞來重新充填這些空的胸腺圓形突出部分,。另外，胸腺的基質(zhì)成分可以被分開也可以分別和祖細(xì)胞組合在一起來研究這些成分在胸腺細(xì)胞分化過程中所起的作用,。最后,，F(xiàn)TOC還可以用于其他許多實(shí)驗(yàn)方法，例如,，可以在其中添加單克隆抗體,，逆轉(zhuǎn)錄病毒，細(xì)胞因子或者多肽,。盡管FTOCs的構(gòu)建很麻煩,，而且只局限于有限的細(xì)胞，但是在體外沒有其他的模型系統(tǒng)能像這種方法能夠?yàn)門細(xì)胞的發(fā)育提供一種整體的環(huán)境,。所以說這種方法是可行的,。雖然T細(xì)胞的正常發(fā)育和分化需要一個(gè)完整的胸腺環(huán)境或者它的基質(zhì)成分組合在一起，雖然這個(gè)理論已經(jīng)得到了公認(rèn),，但是其他的造血細(xì)胞系的發(fā)育依賴于一個(gè)簡(jiǎn)單實(shí)用的培養(yǎng)系統(tǒng)也是事實(shí),。

圖 1

在一個(gè)包含有很多細(xì)胞因子半固體的培養(yǎng)基中，能夠很早的發(fā)現(xiàn)紅髓分化的事件,。更重要的是,，B細(xì)胞分化的模型在過去的十年中已經(jīng)建立起來。在B細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中主要的成分，包括來自于骨髓的基質(zhì)細(xì)胞系和一些明確的細(xì)胞因子,。許多已經(jīng)明確的基質(zhì)細(xì)胞系的特性已經(jīng)被描述出來,，一些已有的特性已經(jīng)被廣泛的利用，例如 Dorshkind等培養(yǎng)出的S17細(xì)胞系,，在這個(gè)領(lǐng)域就得到了很好的應(yīng)用,。其他的基質(zhì)細(xì)胞系也被描述出來，每個(gè)都有其獨(dú)特的性質(zhì),，尤其是由Kodama和他的同事們研究出的OP9細(xì)胞系,，似乎也有許多重要的特性，這里將會(huì)討論一下這些特性,。

OP9細(xì)胞系
OP9細(xì)胞系最初來自于骨髓OP／OP小鼠,，這種小鼠缺乏巨噬細(xì)胞克隆刺激因子（MCSF），OP9細(xì)胞最早用于支持早期造血細(xì)胞以及其后來源于骨髓HSCs的B淋巴細(xì)胞增殖的,。Nakano等研究表明,，OP9細(xì)胞能夠支持來源于胚胎的干細(xì)胞發(fā)育成為造血淋巴細(xì)胞?；|(zhì)細(xì)胞能夠支持造血細(xì)胞的分化,，從某種程度上來說是依靠他們所釋放的細(xì)胞因子來實(shí)現(xiàn)的。而且,，MCSF支持骨髓細(xì)胞的分化,。所以，缺乏MCSF的表達(dá)導(dǎo)致了OP9細(xì)胞可以通過限制ESC來源的骨髓細(xì)胞（這些骨髓細(xì)胞參與了淋巴細(xì)胞的增殖）的克隆擴(kuò)增來達(dá)到支持B細(xì)胞分化的目的,。我們的研究小組就此作了進(jìn)一步的研究,，提煉出了一套試驗(yàn)步驟，實(shí)現(xiàn)了在單層OP9細(xì)胞下可以從ESCs中高效的分化出B細(xì)胞,。更重要的是,，許多研究小組，當(dāng)然也包括我們,，研究表明,，OP9細(xì)胞能夠提供自然殺傷細(xì)胞（NK）分化所需要的環(huán)境,。
所以,，OP9細(xì)胞為誘導(dǎo)從不同來源的祖細(xì)胞分化成淋巴細(xì)胞提供了切實(shí)可行的模型系統(tǒng)。當(dāng)然,，在具有OP9細(xì)胞培養(yǎng)的情況下,，HSCs可以產(chǎn)生很多的造血細(xì)胞系，但是T細(xì)胞顯然是一個(gè)例外,。T細(xì)胞比率的顯著低下是因?yàn)門細(xì)胞的發(fā)育需要一系列的分子與細(xì)胞間的相互作用,。而這些作用單個(gè)基質(zhì)細(xì)胞系是不能夠提供的。所以，可以理所當(dāng)然的得出這樣的結(jié)論,，那就是沒有這些基礎(chǔ)的相互作用,，OP9細(xì)胞既不能引發(fā)T細(xì)胞的產(chǎn)生，也不能支持T細(xì)胞的生長(zhǎng),。

圖2

Notch配體
為了找到缺失的分子相互作用的機(jī)制（這種相互作用可能是OP9細(xì)胞誘導(dǎo)或者支持干細(xì)胞發(fā)育成為T細(xì)胞的一種重要的相互作用）,，我們引入了Notch受體和配體基因家族（圖2）。許多最近的研究表明,，Notch信號(hào)在T細(xì)胞發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要的作用,。尤為重要的是，Notch信號(hào)在決定T－B細(xì)胞命運(yùn)方面起到了關(guān)鍵性的作用,。已經(jīng)明確的一點(diǎn)是,，在廢除B細(xì)胞發(fā)育的小鼠中，骨髓祖細(xì)胞組成性的表達(dá)活化的Notch,，而在這類小鼠中CD4＋CD8＋DPT細(xì)胞則發(fā)育增殖起來,。在補(bǔ)充性的試驗(yàn)中，Notch-1缺限的小鼠則表現(xiàn)出嚴(yán)重的T細(xì)胞發(fā)育缺限,，而且B細(xì)胞會(huì)在胸腺中發(fā)育成熟,。這種結(jié)果就極大的支持Notch在T細(xì)胞發(fā)育的早期起重要作用的推斷。正如圖2所顯示的一樣,，細(xì)胞系的定型得到了細(xì)胞核中釋放的ICN的協(xié)同作用,，ICN可以改變協(xié)同受體和協(xié)同活化相關(guān)的CSL，導(dǎo)致替代性譜系特異性的轉(zhuǎn)錄,。此外,，在調(diào)節(jié)TCR－β基因方面，相比較γδ－T－細(xì)胞而言,，Notch信號(hào)更容易促進(jìn)αβ－T－細(xì)胞的發(fā)育,，影響了CD4＋和CD8＋細(xì)胞的命運(yùn)抉擇。所以這些發(fā)現(xiàn),，和最近的報(bào)道都支持這樣一種觀點(diǎn),，既Notch信號(hào)在T細(xì)胞系定型和分化方面起重要的作用。
因?yàn)橛辛Φ淖C據(jù)證明Notch受體－配體間的相互作用決定著T－B細(xì)胞系轉(zhuǎn)化,，而且和骨髓或者胚胎干細(xì)胞環(huán)境相比較不同的是,，Notch配體大量的表達(dá)在胸腺微環(huán)境中。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無論是OP9細(xì)胞表達(dá)那種Notch配體,，考慮到OP9細(xì)胞來源于骨髓而且為B細(xì)胞的發(fā)育提供了一個(gè)極好的微環(huán)境,，因此，我們有理由相信OP9細(xì)胞不表達(dá)特異性的Notch配體,，因?yàn)镹otch是T細(xì)胞發(fā)育和分化所需要的,。最初的分析表明，OP9細(xì)胞表達(dá)可以較早的檢測(cè)到的鋸齒狀的基因家族成員，而不是似三角狀的基因家族,。所以,，為了研究OP9細(xì)胞異位表達(dá)適當(dāng)量Notch配體是否是導(dǎo)致HSCs從向B細(xì)胞的分化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)橄騎細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)OP9細(xì)胞確實(shí)可以逆向轉(zhuǎn)而表達(dá)似三角狀的Notch配體－1,。

OP9－DL1細(xì)胞
盡管Notch-1在T細(xì)胞分化中的作用已經(jīng)明確,，但是結(jié)合Notch-1以誘導(dǎo)和支持T細(xì)胞分化的適當(dāng)?shù)呐潴w還沒有鑒定出來。但是OP9細(xì)胞雖然表達(dá)鋸齒狀的Notch基因家族但是并不誘導(dǎo)或者支持T細(xì)胞分化的事實(shí)表明,，三角狀Notch家族基因成員可能是其作用的真正因素,。這就產(chǎn)生了表達(dá)似三角狀的Notch家族的OP9細(xì)胞（OP9－DL1）。最近報(bào)道,，OP9－DL1細(xì)胞具有兩種特性,。第一，和對(duì)照性的OP9細(xì)胞相比較,，OP9－DL1細(xì)胞失去了支持HSCs發(fā)育成為B細(xì)胞的能力,。第二，OP9－DL1獲得了誘導(dǎo)HSCs發(fā)育成為T細(xì)胞的正常的程序,，而且可以誘導(dǎo) CD4＋CD8＋DP T細(xì)胞和CD8＋T細(xì)胞的產(chǎn)生,。最顯著的一點(diǎn)是，在OP9誘導(dǎo)下分化的HSCs被標(biāo)記發(fā)現(xiàn),，他們可以克隆擴(kuò)增,，增加γδ－TCR＋和αβTCR＋T細(xì)胞。而且表達(dá)的CD8＋T細(xì)胞在功能上是完全成熟的,。

圖3

這些發(fā)現(xiàn)粉碎了長(zhǎng)期控制免疫領(lǐng)域的一種觀點(diǎn),，即T細(xì)胞不可能在一種簡(jiǎn)單單層基質(zhì)細(xì)胞的幫助下從干細(xì)胞分化成為T細(xì)胞。而且已經(jīng)確定了這樣的一種觀點(diǎn),，B細(xì)胞和T細(xì)胞分化途徑的選擇依賴于似三角狀的Notch分子的交感能力,。所以，對(duì)于淋巴祖細(xì)胞來說它的命運(yùn)就只是單單的依賴于似三角狀分子是否出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞增殖的微環(huán)境中,。當(dāng)出現(xiàn)似三角狀分子時(shí)就選擇分化成為T細(xì)胞,。但是如果不出現(xiàn)或者是這種Notch分子被修飾了，則會(huì)因?yàn)槿菭畹姆肿拥娜毕x擇分化成為B細(xì)胞,。
盡管證據(jù)表明似三角狀分子1對(duì)于細(xì)胞系的選擇起決定作用,但是和似三角狀分子1具有序列同源性的似三角狀分子4可能具有類似的作用,。而且似三角狀分子4也在胸腺表達(dá)。所以,，適當(dāng)?shù)腘otch配體的表達(dá)奠定了胸腺的獨(dú)特性質(zhì),，這可能是作為T細(xì)胞增殖的起點(diǎn),。但是胸腺外,，例如：腸，從某種程度來說也包括脾臟，還有骨髓,，在這些器官中,，淋巴細(xì)胞分化為T細(xì)胞是否也部分的依賴于三角狀分子的表達(dá)尚存在爭(zhēng)議。

OP9-DL1細(xì)胞的應(yīng)用
在一種簡(jiǎn)單的單層基質(zhì)細(xì)胞的作用下,，能夠分化出T細(xì)胞的這種能力不僅有助于回答一個(gè)關(guān)于T細(xì)胞的產(chǎn)生需要分子間的相互作用的基礎(chǔ)性問題,，而且提供一個(gè)研究T細(xì)胞發(fā)育的新系統(tǒng)。在發(fā)現(xiàn)OP9-DL1細(xì)胞之前,，研究T細(xì)胞的發(fā)育需要FTOCs,。這種FTOCs雖然有效，但是很不實(shí)用而且效率相當(dāng)?shù)?。OP9-DL1細(xì)胞相當(dāng)易于培養(yǎng)而且容易增殖,。在圖3顯示了在和OP9-DL1細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下HSCs發(fā)育為T細(xì)胞的簡(jiǎn)單的流程圖。
利用圖3的實(shí)驗(yàn)方法,，可以誘導(dǎo)許多不同來源的祖細(xì)胞發(fā)育成為T細(xì)胞,。但目前為止，我們已經(jīng)可以高效的誘導(dǎo)或者說支持分化為T細(xì)胞的干細(xì)胞有小鼠胚胎肝細(xì)胞來源的HSCs,，從骨髓來源的HSCs,，未分化的ESCs，骨髓來源的淋巴祖細(xì)胞,，胸腺來源的祖細(xì)胞和人Cord血來源的HSCs,。當(dāng)然，這也僅僅是部分羅列,。而且祖細(xì)胞來源的數(shù)量在不久的將來可能會(huì)大大增加,。值得一提的是，世界上許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)得到OP9-DL1細(xì)胞,，而且已經(jīng)把他們用于自己的實(shí)驗(yàn)中,。因此，我們很快能夠更好的評(píng)估在OP9-DL1細(xì)胞的誘導(dǎo)下分化成為T細(xì)胞的不同來源的祖細(xì)胞,，而且一系列的分析檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)方法也將會(huì)應(yīng)用到這個(gè)系統(tǒng)中,。

在圖3中顯示了目前適合OP9-DL1細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的不同的應(yīng)用方法?；贠P9-DL1細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性和高效性,，其重要的應(yīng)用就是單個(gè)細(xì)胞可以被用于研究T細(xì)胞祖細(xì)胞的功能。盡管這一點(diǎn)利用FTOCs系統(tǒng)也可以做到,，但是龐大的分析系統(tǒng)使其可行性幾乎是零,。另外，利用來源難以計(jì)數(shù)的干細(xì)胞包括ESCs產(chǎn)生T細(xì)胞成為可能,。這就可以在T細(xì)胞發(fā)育過程中,，刪除某些基因,，造成一種致死性的表型的方法來研究T細(xì)胞發(fā)育過程中許多基因的作用特性。更重要的是,，通過應(yīng)用siRNA可以分析一種特定基因的重要功能,。例如，在T細(xì)胞發(fā)育過程中,，siRNA能夠被早期用于合適的OP9-DL細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng),。所以和目前應(yīng)用的FTOCs一起用于研究，可以易化T細(xì)胞發(fā)育的研究,，當(dāng)然這里所羅列的方法也會(huì)繼續(xù)增加,。
盡管利用OP9-DL1細(xì)胞共培養(yǎng)方法使得從干細(xì)胞發(fā)育成為具有功能的T細(xì)胞很容易做到，但是這個(gè)系統(tǒng)也有一些缺點(diǎn),。例如,，OP9細(xì)胞不能表達(dá)MHC-II分子，而且似乎也不能表達(dá)CD1d分子,；因此,，這就分別限制了對(duì)于CD4＋T細(xì)胞和NK T細(xì)胞的陽性選擇。但是,，OP9-DL1細(xì)胞無論被修飾后表達(dá),，還是異位表達(dá)都需要重新審視他們?cè)诜只蔀樘禺愋訲細(xì)胞亞形中的作用。很有趣的是,，該系統(tǒng)的另外一個(gè)缺點(diǎn)是,，限制OP9-DL1細(xì)胞的數(shù)量，因?yàn)檫@種細(xì)胞好像能夠向發(fā)育中的T細(xì)胞提呈自身抗原,。例如,，和胸腺骨髓上皮細(xì)胞形成對(duì)比的是，盡管這一點(diǎn)還沒有檢測(cè)但是OP9細(xì)胞不可能表達(dá)自身免疫受體（AIRE）基因,。所以,，處理TCR＋陽性和或者陰性選擇機(jī)制的問題可以通過OP9細(xì)胞的大量繁殖來進(jìn)行研究。但是,，OP9-DL1細(xì)胞恰當(dāng)?shù)倪x擇TCR＋ T細(xì)胞的功能或者能力可以通過簡(jiǎn)單輸入 CD4－CD8 －DN祖細(xì)胞或者CD4＋CD8 ＋ DP T細(xì)胞到FTOCs或者輸入到宿主小鼠中而被消除,。也可以通過干細(xì)胞與OP9-DL1細(xì)胞共同培養(yǎng)而實(shí)現(xiàn)。這種方法不僅提供了一種自身限制性MHC的可行方法,，而且為將來把外源性的T細(xì)胞輸入到體內(nèi)檢測(cè)免疫功能提供了一個(gè)新的方法,。
在體外不同來源的干細(xì)胞能夠高效的產(chǎn)生T祖細(xì)胞的觀點(diǎn)為將來許多重要的實(shí)驗(yàn)提供了可能性。例如,，治療或者臨床上的許多其他方面都用到了這個(gè)系統(tǒng),，或者由這個(gè)系統(tǒng)起源的其他系統(tǒng)。這種可以在體外從已知的干細(xì)胞獲得大量T祖細(xì)胞的能力為獲得性或者遺傳的或者是放射治療或者化療導(dǎo)致的T細(xì)胞性免疫缺陷病創(chuàng)造了新的治療機(jī)會(huì),。而且,，可以體外創(chuàng)造設(shè)計(jì)T細(xì)胞并把它們用于研究抗原特異性的腫瘤免疫治療中,；或者是體外產(chǎn)生調(diào)節(jié)性的T細(xì)胞用于治療自身免疫性疾病。在這個(gè)領(lǐng)域絕大多數(shù)這一類的方法和將來的治療設(shè)想都只是美好的愿望,，但是現(xiàn)在有了這種很容易產(chǎn)生T細(xì)胞的方法,，這些想法變成現(xiàn)實(shí)就容易了很多,。