暨南大學 組織移植與免疫研究中心

胸腺是T淋巴細胞增殖主要的部位。但是,，直到最近才闡明了能夠執(zhí)行精確的分子間的相互作用機制。盡管已經分離鑒定出了許多起重要作用的分子,，這包括可溶性的因子（細胞外間質成分和所有的膜受體以及他們的配體）,，但是，這些分子在胸腺細胞分化過程中的確切作用需要進一步詳盡的闡述,。在這一點上,，這里要討論的一種T細胞從干細胞中發(fā)育的簡單有效的培養(yǎng)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的出現(xiàn)將會大大的簡化T細胞發(fā)育過程的研究,。

眾說周知,，胸腺有一個獨特的性質，就是能夠為來源于骨髓的祖細胞發(fā)育成T細胞提供一個外部環(huán)境,。在缺乏胸腺的情況下（無論是先天的遺傳缺陷還是通過切除新生鼠胸腺造成的胸腺缺陷）,，都只能夠檢測到極少量的外周T細胞，導致嚴重的免疫缺陷,。所以,，很明顯胸腺為T細胞發(fā)育提供了一個適宜的環(huán)境,，在這種環(huán)境下造血干細胞來源的淋巴祖細胞可以發(fā)育成為T細胞,，而且這種理論在過去的十年里已經成為了T細胞發(fā)育的教條。但是,，胸腺到底在T細胞發(fā)育的過程中提供了什么卻不是十分清楚,。從一些簡單的事實得到了一些線索，那就是盡管T細胞和B細胞具有共同的淋巴細胞祖先,，但是他們的發(fā)育的過程和在體內的發(fā)育場所不同的,。B細胞是在骨髓中發(fā)育而來的。但是對于T細胞的發(fā)育來說,，淋巴祖細胞必須離開這種骨髓這種環(huán)境進入胸腺才能夠發(fā)育成為T細胞,。更重要的是，B細胞在體外利用骨髓來源的干細胞系很容易繁殖,。但是,，T細胞的發(fā)育需要復雜胸腺器官。許多科學家對T細胞發(fā)育的胸腺依賴性已經作出了解釋,，這些解釋引出了這樣一種概念,，即在胸腺微觀構造中特異的基質和上皮細胞環(huán)境為T細胞的發(fā)育提供了獨特的信號。
如圖1所示,，T細胞進行了一系列明確的分化步驟,，這些步驟一般根據(jù)細胞表面分子CD4和CD8來劃分的：胸腺細胞始于CD4－CD8－雙陰性（DN）T細胞，接著變成CD4＋CD8＋（DP），最后變?yōu)槌墒斓腃D4＋或者CD8＋單陽性T細胞（SP）,。DN階段可以根據(jù)表面分子CD25和CD44的表達情況進一步的劃分,。圖1還描述出了胸腺的分區(qū)，例如皮質區(qū)和髓質區(qū),。最近Petrie和他的同事們的研究發(fā)現(xiàn),，通過胸腺的分區(qū)發(fā)現(xiàn)，在胸腺細胞發(fā)育過程中,，伴隨著胸腺細胞在胸腺不同區(qū)域中復雜的移動過程,。淋巴祖細胞在皮髓質交界處進入胸腺，接著移動到皮質的外部,，最后返回髓質,。這個過程，包含了許多精細而又同等的選擇事件,。這個假設性的通過胸腺復雜的有指導性的化學運動已經幫助建立起了一種觀念,，那就是T細胞的發(fā)育需要許多獨特的只有在胸腺這個整體環(huán)境下才能夠發(fā)生的相互作用。這一觀點進一步得到了Anderson和他的同事們的闡明,，在胸腺中不同的STROMAL成分不能孤立,，的而只能重新聚集或者組合在一起才能組成一個支持T細胞發(fā)育的三維的空間結構。

淋巴細胞繁殖的體外模型
受淋巴祖細胞發(fā)育成為T細胞的過程需要完整胸腺這種理論的影響,，在體外唯一能夠滿足這種要求的系統(tǒng)就是胚胎胸腺器官的培養(yǎng)系統(tǒng)（FTOC）,。這種FTOC培養(yǎng)系統(tǒng)最早是由Owen和Jenkinson在20世紀80年代提煉出來的。這種FTOC方法提供了一個孤立的可以研究T細胞發(fā)育的方法,，而且允許在其中進行許多重要的實驗性操作,。例如，可以預先用去鹵氧化物處理胸腺使原有的胸腺細胞消耗一空,，而且還允許利用定向的干細胞或者淋巴祖細胞來重新充填這些空的胸腺圓形突出部分,。另外，胸腺的基質成分可以被分開也可以分別和祖細胞組合在一起來研究這些成分在胸腺細胞分化過程中所起的作用,。最后,，F(xiàn)TOC還可以用于其他許多實驗方法，例如,，可以在其中添加單克隆抗體,，逆轉錄病毒，細胞因子或者多肽,。盡管FTOCs的構建很麻煩,，而且只局限于有限的細胞，但是在體外沒有其他的模型系統(tǒng)能像這種方法能夠為T細胞的發(fā)育提供一種整體的環(huán)境,。所以說這種方法是可行的,。雖然T細胞的正常發(fā)育和分化需要一個完整的胸腺環(huán)境或者它的基質成分組合在一起,，雖然這個理論已經得到了公認，但是其他的造血細胞系的發(fā)育依賴于一個簡單實用的培養(yǎng)系統(tǒng)也是事實,。

圖 1

在一個包含有很多細胞因子半固體的培養(yǎng)基中,，能夠很早的發(fā)現(xiàn)紅髓分化的事件。更重要的是,，B細胞分化的模型在過去的十年中已經建立起來,。在B細胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中主要的成分，包括來自于骨髓的基質細胞系和一些明確的細胞因子,。許多已經明確的基質細胞系的特性已經被描述出來,，一些已有的特性已經被廣泛的利用，例如 Dorshkind等培養(yǎng)出的S17細胞系,，在這個領域就得到了很好的應用,。其他的基質細胞系也被描述出來，每個都有其獨特的性質,，尤其是由Kodama和他的同事們研究出的OP9細胞系,，似乎也有許多重要的特性，這里將會討論一下這些特性,。

OP9細胞系
OP9細胞系最初來自于骨髓OP／OP小鼠,，這種小鼠缺乏巨噬細胞克隆刺激因子（MCSF），OP9細胞最早用于支持早期造血細胞以及其后來源于骨髓HSCs的B淋巴細胞增殖的,。Nakano等研究表明,，OP9細胞能夠支持來源于胚胎的干細胞發(fā)育成為造血淋巴細胞?；|細胞能夠支持造血細胞的分化,，從某種程度上來說是依靠他們所釋放的細胞因子來實現(xiàn)的,。而且,，MCSF支持骨髓細胞的分化。所以,，缺乏MCSF的表達導致了OP9細胞可以通過限制ESC來源的骨髓細胞（這些骨髓細胞參與了淋巴細胞的增殖）的克隆擴增來達到支持B細胞分化的目的,。我們的研究小組就此作了進一步的研究，提煉出了一套試驗步驟,，實現(xiàn)了在單層OP9細胞下可以從ESCs中高效的分化出B細胞,。更重要的是，許多研究小組,，當然也包括我們,，研究表明，OP9細胞能夠提供自然殺傷細胞（NK）分化所需要的環(huán)境,。
所以,，OP9細胞為誘導從不同來源的祖細胞分化成淋巴細胞提供了切實可行的模型系統(tǒng),。當然，在具有OP9細胞培養(yǎng)的情況下,，HSCs可以產生很多的造血細胞系,，但是T細胞顯然是一個例外。T細胞比率的顯著低下是因為T細胞的發(fā)育需要一系列的分子與細胞間的相互作用,。而這些作用單個基質細胞系是不能夠提供的,。所以，可以理所當然的得出這樣的結論,，那就是沒有這些基礎的相互作用,，OP9細胞既不能引發(fā)T細胞的產生，也不能支持T細胞的生長,。

圖2

Notch配體
為了找到缺失的分子相互作用的機制（這種相互作用可能是OP9細胞誘導或者支持干細胞發(fā)育成為T細胞的一種重要的相互作用）,，我們引入了Notch受體和配體基因家族（圖2）。許多最近的研究表明,，Notch信號在T細胞發(fā)育的不同階段發(fā)揮重要的作用,。尤為重要的是，Notch信號在決定T－B細胞命運方面起到了關鍵性的作用,。已經明確的一點是,，在廢除B細胞發(fā)育的小鼠中，骨髓祖細胞組成性的表達活化的Notch,，而在這類小鼠中CD4＋CD8＋DPT細胞則發(fā)育增殖起來,。在補充性的試驗中，Notch-1缺限的小鼠則表現(xiàn)出嚴重的T細胞發(fā)育缺限,，而且B細胞會在胸腺中發(fā)育成熟,。這種結果就極大的支持Notch在T細胞發(fā)育的早期起重要作用的推斷。正如圖2所顯示的一樣,，細胞系的定型得到了細胞核中釋放的ICN的協(xié)同作用,，ICN可以改變協(xié)同受體和協(xié)同活化相關的CSL，導致替代性譜系特異性的轉錄,。此外,，在調節(jié)TCR－β基因方面，相比較γδ－T－細胞而言,，Notch信號更容易促進αβ－T－細胞的發(fā)育,，影響了CD4＋和CD8＋細胞的命運抉擇。所以這些發(fā)現(xiàn),，和最近的報道都支持這樣一種觀點,，既Notch信號在T細胞系定型和分化方面起重要的作用。
因為有力的證據(jù)證明Notch受體－配體間的相互作用決定著T－B細胞系轉化,，而且和骨髓或者胚胎干細胞環(huán)境相比較不同的是,，Notch配體大量的表達在胸腺微環(huán)境中,。檢測發(fā)現(xiàn)無論是OP9細胞表達那種Notch配體，考慮到OP9細胞來源于骨髓而且為B細胞的發(fā)育提供了一個極好的微環(huán)境,，因此,，我們有理由相信OP9細胞不表達特異性的Notch配體，因為Notch是T細胞發(fā)育和分化所需要的,。最初的分析表明,，OP9細胞表達可以較早的檢測到的鋸齒狀的基因家族成員，而不是似三角狀的基因家族,。所以,，為了研究OP9細胞異位表達適當量Notch配體是否是導致HSCs從向B細胞的分化途徑轉變?yōu)橄騎細胞分化，發(fā)現(xiàn)OP9細胞確實可以逆向轉而表達似三角狀的Notch配體－1,。

OP9－DL1細胞
盡管Notch-1在T細胞分化中的作用已經明確,，但是結合Notch-1以誘導和支持T細胞分化的適當?shù)呐潴w還沒有鑒定出來。但是OP9細胞雖然表達鋸齒狀的Notch基因家族但是并不誘導或者支持T細胞分化的事實表明,，三角狀Notch家族基因成員可能是其作用的真正因素,。這就產生了表達似三角狀的Notch家族的OP9細胞（OP9－DL1）。最近報道,，OP9－DL1細胞具有兩種特性,。第一，和對照性的OP9細胞相比較,，OP9－DL1細胞失去了支持HSCs發(fā)育成為B細胞的能力,。第二，OP9－DL1獲得了誘導HSCs發(fā)育成為T細胞的正常的程序,，而且可以誘導 CD4＋CD8＋DP T細胞和CD8＋T細胞的產生,。最顯著的一點是，在OP9誘導下分化的HSCs被標記發(fā)現(xiàn),，他們可以克隆擴增,，增加γδ－TCR＋和αβTCR＋T細胞。而且表達的CD8＋T細胞在功能上是完全成熟的,。

圖3

這些發(fā)現(xiàn)粉碎了長期控制免疫領域的一種觀點,，即T細胞不可能在一種簡單單層基質細胞的幫助下從干細胞分化成為T細胞,。而且已經確定了這樣的一種觀點,，B細胞和T細胞分化途徑的選擇依賴于似三角狀的Notch分子的交感能力。所以,，對于淋巴祖細胞來說它的命運就只是單單的依賴于似三角狀分子是否出現(xiàn)在淋巴細胞增殖的微環(huán)境中,。當出現(xiàn)似三角狀分子時就選擇分化成為T細胞。但是如果不出現(xiàn)或者是這種Notch分子被修飾了,，則會因為三角狀的分子的缺席而選擇分化成為B細胞,。
盡管證據(jù)表明似三角狀分子1對于細胞系的選擇起決定作用,但是和似三角狀分子1具有序列同源性的似三角狀分子4可能具有類似的作用,。而且似三角狀分子4也在胸腺表達。所以,，適當?shù)腘otch配體的表達奠定了胸腺的獨特性質,，這可能是作為T細胞增殖的起點。但是胸腺外,，例如：腸,，從某種程度來說也包括脾臟，還有骨髓,，在這些器官中,，淋巴細胞分化為T細胞是否也部分的依賴于三角狀分子的表達尚存在爭議。

OP9-DL1細胞的應用
在一種簡單的單層基質細胞的作用下,，能夠分化出T細胞的這種能力不僅有助于回答一個關于T細胞的產生需要分子間的相互作用的基礎性問題,，而且提供一個研究T細胞發(fā)育的新系統(tǒng)。在發(fā)現(xiàn)OP9-DL1細胞之前,，研究T細胞的發(fā)育需要FTOCs,。這種FTOCs雖然有效，但是很不實用而且效率相當?shù)?。OP9-DL1細胞相當易于培養(yǎng)而且容易增殖,。在圖3顯示了在和OP9-DL1細胞共培養(yǎng)的情況下HSCs發(fā)育為T細胞的簡單的流程圖。
利用圖3的實驗方法,，可以誘導許多不同來源的祖細胞發(fā)育成為T細胞,。但目前為止，我們已經可以高效的誘導或者說支持分化為T細胞的干細胞有小鼠胚胎肝細胞來源的HSCs,，從骨髓來源的HSCs,，未分化的ESCs，骨髓來源的淋巴祖細胞,，胸腺來源的祖細胞和人Cord血來源的HSCs,。當然，這也僅僅是部分羅列,。而且祖細胞來源的數(shù)量在不久的將來可能會大大增加,。值得一提的是，世界上許多實驗室已經得到OP9-DL1細胞,，而且已經把他們用于自己的實驗中,。因此，我們很快能夠更好的評估在OP9-DL1細胞的誘導下分化成為T細胞的不同來源的祖細胞,，而且一系列的分析檢測方法和實驗方法也將會應用到這個系統(tǒng)中,。

在圖3中顯示了目前適合OP9-DL1細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的不同的應用方法?；贠P9-DL1細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的簡單性和高效性,，其重要的應用就是單個細胞可以被用于研究T細胞祖細胞的功能,。盡管這一點利用FTOCs系統(tǒng)也可以做到，但是龐大的分析系統(tǒng)使其可行性幾乎是零,。另外,，利用來源難以計數(shù)的干細胞包括ESCs產生T細胞成為可能。這就可以在T細胞發(fā)育過程中,，刪除某些基因,，造成一種致死性的表型的方法來研究T細胞發(fā)育過程中許多基因的作用特性。更重要的是,，通過應用siRNA可以分析一種特定基因的重要功能,。例如，在T細胞發(fā)育過程中,，siRNA能夠被早期用于合適的OP9-DL細胞共培養(yǎng)系統(tǒng),。所以和目前應用的FTOCs一起用于研究，可以易化T細胞發(fā)育的研究,，當然這里所羅列的方法也會繼續(xù)增加,。
盡管利用OP9-DL1細胞共培養(yǎng)方法使得從干細胞發(fā)育成為具有功能的T細胞很容易做到，但是這個系統(tǒng)也有一些缺點,。例如,，OP9細胞不能表達MHC-II分子，而且似乎也不能表達CD1d分子,；因此,，這就分別限制了對于CD4＋T細胞和NK T細胞的陽性選擇。但是,，OP9-DL1細胞無論被修飾后表達,，還是異位表達都需要重新審視他們在分化成為特異性T細胞亞形中的作用。很有趣的是,，該系統(tǒng)的另外一個缺點是,，限制OP9-DL1細胞的數(shù)量，因為這種細胞好像能夠向發(fā)育中的T細胞提呈自身抗原,。例如,，和胸腺骨髓上皮細胞形成對比的是，盡管這一點還沒有檢測但是OP9細胞不可能表達自身免疫受體（AIRE）基因,。所以,，處理TCR＋陽性和或者陰性選擇機制的問題可以通過OP9細胞的大量繁殖來進行研究。但是,，OP9-DL1細胞恰當?shù)倪x擇TCR＋ T細胞的功能或者能力可以通過簡單輸入 CD4－CD8 －DN祖細胞或者CD4＋CD8 ＋ DP T細胞到FTOCs或者輸入到宿主小鼠中而被消除,。也可以通過干細胞與OP9-DL1細胞共同培養(yǎng)而實現(xiàn)。這種方法不僅提供了一種自身限制性MHC的可行方法,，而且為將來把外源性的T細胞輸入到體內檢測免疫功能提供了一個新的方法,。
在體外不同來源的干細胞能夠高效的產生T祖細胞的觀點為將來許多重要的實驗提供了可能性。例如,，治療或者臨床上的許多其他方面都用到了這個系統(tǒng),，或者由這個系統(tǒng)起源的其他系統(tǒng)。這種可以在體外從已知的干細胞獲得大量T祖細胞的能力為獲得性或者遺傳的或者是放射治療或者化療導致的T細胞性免疫缺陷病創(chuàng)造了新的治療機會,。而且,，可以體外創(chuàng)造設計T細胞并把它們用于研究抗原特異性的腫瘤免疫治療中；或者是體外產生調節(jié)性的T細胞用于治療自身免疫性疾病,。在這個領域絕大多數(shù)這一類的方法和將來的治療設想都只是美好的愿望,，但是現(xiàn)在有了這種很容易產生T細胞的方法，這些想法變成現(xiàn)實就容易了很多,。