黃鳳婷 綜述

中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院

摘要：本文就DNA疫苗的免疫機(jī)制，注射途徑,，影響免疫效果的因素,，特點(diǎn)，及存在的問(wèn)題做一綜述,。
關(guān)鍵詞：DNA疫苗,；免疫機(jī)制；細(xì)胞免疫,；體液免疫,；基因槍；佐劑

1． 引言
隨著科技的發(fā)展,，疫苗技術(shù)也在不斷進(jìn)步,，從傳統(tǒng)的死疫苗，減毒活疫苗發(fā)展到近幾年十分熱門的DNA疫苗,。DNA疫苗是指用編碼病原體有效免疫原的基因與細(xì)菌質(zhì)粒構(gòu)建的重組體,。用DN A疫苗免疫可有相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)可在體內(nèi)誘生特異性體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答,，也被稱為裸 DNA疫苗,，因?yàn)闃?gòu)成乙醚靠的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物中只有DNA而缺乏蛋白質(zhì)。DNA疫苗與傳統(tǒng)的疫苗相比,，有許多嶄新的優(yōu)點(diǎn),，被稱為第四代疫苗。

2． DNA疫苗免疫機(jī)制
DNA疫苗常用于表皮,，肌肉和靜脈接種DNA,，均可產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。
皮膚接種常用于表皮或皮下接種方式,。皮膚及黏膜組織大多首先與外來(lái)抗原接觸,。在皮膚相關(guān)的淋巴組織中含有多種 促進(jìn)免疫應(yīng)答的專一細(xì)胞。其中角質(zhì)細(xì)胞為主要表達(dá)細(xì)胞。它可產(chǎn)生IL-1,TNF-a,，可激活表皮中的APC如樹突狀細(xì)胞,，巨噬細(xì)胞，朗罕細(xì)胞,，將攝取和加工處理的抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴結(jié),。這些細(xì)胞除可直接攝取和表達(dá)質(zhì)粒DNA外，還可攝取,，表達(dá)由死細(xì)胞釋放的外源DNA,。在外源基因啟動(dòng)子作用下，使外源基因表達(dá),，產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)水解酶的作用下分解成長(zhǎng)短不一的多肽,。其中一部分轉(zhuǎn)移至內(nèi)侄內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔內(nèi)，與新組裝的MHC-I類分子結(jié)合形成抗原肽：MHC-I類分子復(fù)合物,，逼供內(nèi)提呈給CD8+T細(xì)胞,，誘發(fā)特異性細(xì)胞殺傷效應(yīng)。另一部分轉(zhuǎn)移到溶酶體和內(nèi)體,，經(jīng)加工處理降解為多肽,，與MHC-II類分子形成抗原肽：MHC-II類分子復(fù)合物，將抗原提呈給CD4+T細(xì)胞,，活化的 Th1型CD4+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,，并使巨噬細(xì)胞活化，活化的巨噬細(xì)胞能吞噬胞內(nèi)寄生病原生物,，如結(jié)核桿菌,，麻風(fēng)桿菌等，也能吞噬所中胞外細(xì)菌,。活化的Th2型CD4+T細(xì)胞分泌IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,與 B細(xì)胞增殖,，成熟,，促進(jìn)抗體生成有關(guān)，可增強(qiáng)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答,。
骨骼肌細(xì)胞是目前所知攝取外源DNA效率最高的組織,。但無(wú)MHC-II類分子，只表達(dá)較少的MHC-I類分子,，缺乏共刺激分子B7的專職APC,，但非專職APC也可有效地將抗原提呈給T細(xì)胞。由 T細(xì)胞接受肌肉細(xì)胞表達(dá)的抗原肽：MHC-I類分子復(fù)合物的第一信號(hào),，同時(shí)接受炎癥反應(yīng)吸引的來(lái)自血液免疫細(xì)胞所帶的共刺激信號(hào)而活化,。提示抗原提呈與共刺激新并不是要由同一細(xì)胞提供，此外，肌肉細(xì)胞表達(dá)的抗原可通過(guò)某些途徑轉(zhuǎn)移到專職APC 內(nèi),，由專職APC將抗原加工處理后,，提呈給CD4+T細(xì)胞,CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)出細(xì)胞免疫和體液免疫,。盡管肌細(xì)胞本身不足以誘導(dǎo)CTL ,但肌細(xì)胞通過(guò)表達(dá)多種細(xì)胞因子,，當(dāng)表達(dá)IFN-a,TNF-a時(shí)可誘導(dǎo)MHC-I,MHC-II類分子ICAM-1/CD54, LFA-1,LFA-2,LFA-3的表達(dá)，由此可誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫,。

3． DNA疫苗的注射途徑
l 直接肌肉注射
注射的DNA在肌肉細(xì)胞中以環(huán)型分子存在,，不能復(fù)制，并不能整合到宿主細(xì)胞染色體中,。肌肉細(xì)胞中特有的橫管系統(tǒng)與細(xì)胞外空間有直接交通,，因而可能介導(dǎo)質(zhì)粒 DNA的內(nèi)吞作用。而且橫紋肌中溶酶體和DNA酶的含量較低,，可能也是質(zhì)粒DNA能在細(xì)胞中存在較長(zhǎng)時(shí)間的原因,。
l 微離子轟擊介導(dǎo)的DNA免疫
即基因槍。其技術(shù)依據(jù)是亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA,，將包裹有金粉或鎢粉的 DNA 質(zhì)粒,，借助高能電場(chǎng)以極快的速度轟擊動(dòng)物表皮組織，能獲得滿意的免疫效果,。

4． 影響DNA 疫苗免疫效果的主要因素
接種方式
Leitner等將編碼瘧原蟲環(huán)子孢子抗原的質(zhì)粒通過(guò)肌注途徑和基因槍介導(dǎo)的表皮途徑免疫BALB/C小鼠,。研究發(fā)現(xiàn)，基因槍皮內(nèi)接種比肌肉內(nèi)直接注射的免疫效果要好,。免疫效果前者比后者高600-6000倍,，且所用DNA劑量也減少。由肌肉注射的100-200ugDNA疫苗減至用0.04-0.4ug純化的DNAS,。
接種途徑
Fynan等發(fā)現(xiàn)骨骼肌注射接種免疫效果最佳,。真皮，表皮,，靜脈注射效果較好,。腹腔內(nèi)注射效果較差。
接種部位的預(yù)處理
Davis等對(duì)小鼠免疫前肌肉注射100ul 10mmol/L心肌毒素,，然后接種HbsDNA疫苗,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗Hbs抗體水平比對(duì)照組高10倍以上。另有實(shí)驗(yàn)表明,，在注射部位用25%高滲蔗糖進(jìn)行預(yù)處理,，可提高疫苗DNA的表達(dá)水平。Danko等在接種DNA疫苗前7天注射0.5%-0.75%丁哌卡,，是疫苗DNA的表達(dá)水平提高40倍以上
接種劑量和次數(shù)
研究表明,，免疫應(yīng)答的強(qiáng)度與免疫劑量和次數(shù)有一定的關(guān)系,。DNA疫苗在臨床試驗(yàn)的免疫程序一般是3次，Ｕｌｍｅｒ等報(bào)告,，給小鼠分別注射１～１００ｕｇ甲型流感病毒ＨＡ或ＮＰ ＤＮＡ疫苗,，結(jié)果抗～ＨＡ和抗～ＮＰ水平與接種劑量呈正相關(guān)。
免疫佐劑
佐劑種類很多,。近幾年發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子也具有明顯的佐劑效應(yīng),，例如IL-1,IL-2,IL-6,IL-12,GM-CSF等。Weiner等用包含CpG序列的DNA作為免疫佐劑和一種淋巴瘤抗原共同免疫小鼠,，免疫后小鼠能抵抗攻毒試驗(yàn),，且CpG佐劑的毒性比完全福氏佐劑低得多。最近,，Rodriguez等利用泛素佐劑將淋巴細(xì)胞腺絡(luò)叢腦炎病毒的核心蛋白（NP）泛素化,。泛素化的抗原被快速降解。NP在胞內(nèi)的快速降解使它不能誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫,。但卻提高了它 被MHC-I類分子識(shí)別提呈的幾率,，從而大大提高了CTL的活性。
凋亡信號(hào)分子
Shin sasaki等將凋亡信號(hào)分子（Capase1 DNA）做簡(jiǎn)單的突變,，減慢凋亡的速度,，并把此分子與血紅球凝集素和淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦炎病毒的核心蛋白（NP）DNA疫苗共表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，細(xì)胞免疫顯著增強(qiáng),。

5． DNA疫苗的特點(diǎn)
DNA疫苗能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。
消除導(dǎo)入可能與"減毒"疫苗相關(guān)的強(qiáng)毒力病毒的危險(xiǎn)性,。
使用一次,，即能產(chǎn)生長(zhǎng)期免疫力，無(wú)須增加劑量,，并可提高依從性,。
多個(gè)病原體的基因可裝在同一個(gè)質(zhì)粒上，減少了疫時(shí)多次注射的不適,。
DNA可以干粉形式保存數(shù)年,，且仍保持起活性。
質(zhì)粒載體的免疫原性,，不會(huì)引發(fā)針對(duì)載體的免疫反應(yīng)，因而可重復(fù)使用或聯(lián)合使用,。

6． DNA疫苗存在的問(wèn)題
目前，DNA疫苗尚未得到廣泛的應(yīng)用,，除了因?yàn)樗且环N新事物,，不大為人所了解之外,，它本身的安全問(wèn)題則是人們對(duì)它 的最大顧慮,。DNA疫苗存在的問(wèn)題如下：
外源DNA進(jìn)入機(jī)體后是否整合到宿主基因組,，導(dǎo)致癌基因激活或抑癌基因失活,。
疫苗DNA長(zhǎng)期在體內(nèi)表達(dá)是否會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受,，長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)說(shuō)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下,。
疫苗DNA 作為一種外來(lái)物質(zhì)，是否會(huì)引起機(jī)體產(chǎn)生抗DNA抗體,。

DNA疫苗誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)是否會(huì)對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,。

7． 結(jié)束語(yǔ)
DNA疫苗作一種嶄新的疫苗,，它具有傳統(tǒng)疫苗所沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn),。盡管目前還有問(wèn)題尚待解決，不過(guò)我相信在不久的將來(lái),，DNA疫苗會(huì)被廣泛的使用,。