王明永
貴陽醫(yī)學院微生物學教研室
摘要 幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori ；Hp）是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，與胃腺癌和胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關,。Hp在我國和世界上感染十分普遍,，人一經(jīng)獲得便可在胃內(nèi)持續(xù)數(shù)年乃至一生，從而引起一部分人發(fā)病,。HP在我國普通人群中發(fā)病率較高,，感染的年齡也較早，而且隨著年齡的增長,，HP的感染率及胃癌的發(fā)病率同步增長,，HP感染者發(fā)生胃癌的危險性較非感染者高4-6倍。因此只要預防和治愈了HP的感染,，將有可能大幅度的降低消化性潰瘍和胃癌的發(fā)病率和致死率,。與其他感染性疾病一樣，免疫療法有望成為該菌感染的最有效,、最有前景的方法之一,，因此抗HP疫苗的研究有重大意義。
關鍵詞 幽門螺旋桿菌 熱休克蛋白70 DNA疫苗
HP是目前胃腸道感染性疾病研究中最熱門的致病菌之一,，由于它的存在與消化道多種疾病密切相關,，為此人們?yōu)榍宄摼母腥具M行了大量的動物實驗和臨床研究。目前發(fā)現(xiàn)HP的抗原成分：熱休克蛋白（HSP）,、尿素酶,、細胞空泡毒素等及其亞單位成分均可以作為免疫原刺激機體產(chǎn)生保護性的免疫反應。幽門螺桿菌(H.pylori)疫苗用以預防和治療,可大大減低與本菌感染相關的疾病,故其意義重大,。動物模型H.pylori除人類以外僅能存在于猴及無菌仔豬胃中,。因其無鼠類小動物模型,遂用能定棲于小鼠胃粘膜并引起胃炎的H.felis作為螺桿菌感染模型,又有用H.mustelae感染白鼬作為研制疫苗實驗動物模型者。最近,Fox等發(fā)現(xiàn)H.pylori能自然感染貓并導致胃炎,遂采用新生貓崽作為H.pylori感染模型,?；魜y毒素的佐劑效果Elson等曾報告,小鼠投予霍亂毒素(CT,為分子量約85kDa的蛋白質(zhì),含1個分子量約28kDa的A亞單位及6個分子量約10kDa的B亞單位,后者無毒性而與細胞膜結(jié)合性有關,10μg于小鼠可起佐劑作用)可使淋巴組織中的B細胞增強,而產(chǎn)生IgA抗體,。Nedrud等則報道將仙臺病毒同CT經(jīng)口投予,可使小鼠特異性IgA抗體增加,。如上所述,可以確認CT具有佐劑效果。Czinn與Nedrud等給BALB/c小鼠投以H.pylori超聲波破碎物1mg(免疫原)和CT10μg(佐劑),或給白鼬分別投以免疫原7mg和CT60μg喂服,發(fā)現(xiàn)動物腸管粘液中的抗H.pyloriIgA抗體顯著增升,血中抗H.pyloriIgA及IgG抗體亦呈上升,亦即證實CT確可使腸管粘膜的抗H.pyloriIgA抗體形成增強,。于時,發(fā)現(xiàn)了經(jīng)口疫苗有效的可能性,展開了H.pylori疫苗的研制,。H.felis疫苗實驗Czinn等(1993)將H.felis的超聲波粉碎提取抗原與CT經(jīng)口投予無菌小鼠,確證血中、胃粘膜和腸粘膜中IgA,、IgG抗體明顯上升后,過7～10天經(jīng)口感染以H.felis活菌,結(jié)果免疫組僅4/17只受染,而對照組有14/18只受染,說明免疫組動物確實獲得預防感染效果,。
細菌熱休克蛋白是在大多數(shù)微生物感染過程中產(chǎn)生的一組對細菌具有保護作用的膜相關蛋白，是1974年Tissieres等人在研究溫度急劇升高后,，果蠅各種細胞蛋白質(zhì)合成所發(fā)生的變化時首先發(fā)現(xiàn),。后來還發(fā)現(xiàn)，不僅熱刺激，而且其他因素,，如化學毒物的刺激,，也能誘導細胞合成此類蛋白質(zhì)，并發(fā)生某些變化,，是細胞應激反應的產(chǎn)物,，故熱休克蛋白也稱為應激蛋白。幽門螺桿菌合成的熱休克蛋白已鑒定的有Hsp10,、Hsp10,、Hsp10。在我國,，李明峰等人已經(jīng)克窿和表達 了幽門螺桿菌熱休克蛋白Hsp10,，了解了它們對蛋白質(zhì)的折疊和分泌的作用。現(xiàn)在認為Hsp10在細菌的致病機制中起著重要的作用,，如它可介導免疫調(diào)節(jié),、介導病原與宿主間的識別和黏附。Huesea等研究表明,，當幽門螺桿菌在模擬胃內(nèi)環(huán)境的低pH環(huán)境中時,，Hp與其受體分子的結(jié)合特性會發(fā)生明顯的變化，由于和Hp的Hsp70是受酸而不是耐熱的,，故它們提出了Hp與胃黏膜黏附的雙受體模型,，即胃內(nèi)的低pH環(huán)境上調(diào)Hsp70的表達，表達的Hsp70呈現(xiàn)到細菌表面介導Hp與黏附層的硫苷脂結(jié)合：Hp穿過黏膜后再發(fā)生隨后的胃上皮受體的結(jié)合,。劉純杰等克窿和表達了Hsp70基因,，實現(xiàn)了該基因的融合分泌表達
Hp的致病機制到目前仍沒有完全明了，但它應該包括適應胃內(nèi)環(huán)境,、黏附和致病等環(huán)節(jié),。據(jù)認為有多種黏附分子參與了Hp與胃黏膜上皮的黏附過程，熱休克蛋白（heat shock protein,，hsp）便是其中一種,。1998年，huesca等報道,，Hp的hsp70是一種可能的介導硫甘脂識別的黏附分子,。為了進一步探討Hp hsp70在細胞黏附中的作用及抗hsp70免疫在機體防止Hp在胃內(nèi)定居的可能性，我們擬在真核細胞中表達此基因,。
研究前景 DNA疫苗是繼減毒,、滅活的全病原體疫苗和基因工程表達的亞單位疫苗之后的免疫預防研究領域的第三次革命。1993年Ulmer等首次以流感病毒的血凝素(HA)抗原的DNA疫苗表達載體進行免疫接種并獲得保護性免疫應答以后,關于DNA疫苗的研究進展迅速,。病毒感染性疾病與腫瘤免疫的應答機制研究表明,之所以會出現(xiàn)病毒感染的慢性化或針對腫瘤細胞的免疫耐受,不僅是因為缺乏來源于病原體或腫瘤的有效抗原,而且還因為這些抗原的加工與提呈過程出現(xiàn)異常,因而不能十分有效地刺激機體產(chǎn)生保護性免疫應答,。如一些慢性乙肝患者體內(nèi)存在著相當數(shù)量的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),卻又不能誘導機體產(chǎn)生針對乙肝病毒有效的免疫應答,以清除體內(nèi)的乙肝病毒,。目前認為肝細胞雖然是分泌表達HBsAg的主要細胞類型,卻不是一種很好的抗原加工與提呈細胞。近年來對于肌肉中的成肌細胞,、皮膚的樹突狀細胞進行研究,發(fā)現(xiàn)這兩種細胞是很好的抗原加工與提呈細胞,。肌肉或皮下注射DNA疫苗以后,這些細胞不僅能夠攝取、表達注射的質(zhì)粒DNA,而且在蛋白質(zhì)合成以后,蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的膜系統(tǒng)運輸與分泌過程中,能夠?qū)τ谶@些抗原成份進行加工,并與MHC抗原分子進行正確作用與結(jié)合,然后作為一種復合物形式表達在細胞表面,從而成為重要的抗原提呈細胞,。這就是DNA疫苗研究的主要理論基礎,。
關于抗HSP70疫苗的研制，目前國內(nèi)外也主要集中在口服疫苗的構(gòu)建,。然而由于多數(shù)非復制性的抗原經(jīng)口服后其免疫原性非常弱,，不能靶向運載至腸到的黏膜免疫系統(tǒng)，同時抗原容易被消化和降解,，且胃腸的吸收率很低,，無法刺激有效的免疫應答。DNA疫苗是將編碼免疫原的基因插入細菌表達質(zhì)粒,，直接接種重組質(zhì)粒,，后者在體內(nèi)表達并誘導免疫保護應答的抗原。其優(yōu)點為：簡便,，無需體外表達,、純化抗原和應用佐劑?？稍隗w內(nèi)持續(xù)表達,，從而可持續(xù)刺激機體產(chǎn)生免役應答，免疫效果好,。能夠克服其它疫苗很多缺點,，具有很好的發(fā)展前途。我們擬構(gòu)建hsp70DNA疫苗,，并在真核細胞上表達hsp70,，將表達hsp70的真核細胞免疫家兔，測家兔血清抗hsp70效價,。
目前防治Hp的手段主要是抗生素的應用,，但由于該菌產(chǎn)生耐藥性，使得抗菌療法日益受到限制,，因此尋找有效的,、安全的Hp疫苗顯得十分重要,。目前,，關于hsp70的國內(nèi)外研究主要集中在原核生物上的表達及其功能方面的研究。對于hsp70在真核生物上的表達,，國內(nèi)外鮮有報道,，對于抗hsp70 DNA疫苗的研制,，更鮮有報道。由于hsp70在原核生物的表達有其固有的缺陷性,，表達產(chǎn)物是沒有活性的包涵體,。所以應用價值不大。本研究以真核細胞為表達載體,，實現(xiàn)hsp70在真核生物上的表達,，并直接用裸DNA肌肉注射免疫家兔，獲得一定的免疫反應,，為通過基因疫苗的方法防治Hp感染提供新的手段,。
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