王明永
貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室
摘要 幽門螺旋桿菌（helicobacter pylori ,；Hp）是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子,，與胃腺癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),。Hp在我國(guó)和世界上感染十分普遍，人一經(jīng)獲得便可在胃內(nèi)持續(xù)數(shù)年乃至一生,，從而引起一部分人發(fā)病,。HP在我國(guó)普通人群中發(fā)病率較高，感染的年齡也較早,，而且隨著年齡的增長(zhǎng),，HP的感染率及胃癌的發(fā)病率同步增長(zhǎng)，HP感染者發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性較非感染者高4-6倍,。因此只要預(yù)防和治愈了HP的感染,，將有可能大幅度的降低消化性潰瘍和胃癌的發(fā)病率和致死率。與其他感染性疾病一樣,，免疫療法有望成為該菌感染的最有效,、最有前景的方法之一，因此抗HP疫苗的研究有重大意義,。
關(guān)鍵詞 幽門螺旋桿菌 熱休克蛋白70 DNA疫苗
HP是目前胃腸道感染性疾病研究中最熱門的致病菌之一,，由于它的存在與消化道多種疾病密切相關(guān)，為此人們?yōu)榍宄摼母腥具M(jìn)行了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究,。目前發(fā)現(xiàn)HP的抗原成分：熱休克蛋白（HSP）,、尿素酶、細(xì)胞空泡毒素等及其亞單位成分均可以作為免疫原刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng),。幽門螺桿菌(H.pylori)疫苗用以預(yù)防和治療,可大大減低與本菌感染相關(guān)的疾病,故其意義重大,。動(dòng)物模型H.pylori除人類以外僅能存在于猴及無菌仔豬胃中。因其無鼠類小動(dòng)物模型,遂用能定棲于小鼠胃粘膜并引起胃炎的H.felis作為螺桿菌感染模型,又有用H.mustelae感染白鼬作為研制疫苗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型者,。最近,Fox等發(fā)現(xiàn)H.pylori能自然感染貓并導(dǎo)致胃炎,遂采用新生貓崽作為H.pylori感染模型?；魜y毒素的佐劑效果Elson等曾報(bào)告,小鼠投予霍亂毒素(CT,為分子量約85kDa的蛋白質(zhì),含1個(gè)分子量約28kDa的A亞單位及6個(gè)分子量約10kDa的B亞單位,后者無毒性而與細(xì)胞膜結(jié)合性有關(guān),10μg于小鼠可起佐劑作用)可使淋巴組織中的B細(xì)胞增強(qiáng),而產(chǎn)生IgA抗體,。Nedrud等則報(bào)道將仙臺(tái)病毒同CT經(jīng)口投予,可使小鼠特異性IgA抗體增加。如上所述,可以確認(rèn)CT具有佐劑效果,。Czinn與Nedrud等給BALB/c小鼠投以H.pylori超聲波破碎物1mg(免疫原)和CT10μg(佐劑),或給白鼬分別投以免疫原7mg和CT60μg喂服,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腸管粘液中的抗H.pyloriIgA抗體顯著增升,血中抗H.pyloriIgA及IgG抗體亦呈上升,亦即證實(shí)CT確可使腸管粘膜的抗H.pyloriIgA抗體形成增強(qiáng),。于時(shí),發(fā)現(xiàn)了經(jīng)口疫苗有效的可能性,展開了H.pylori疫苗的研制。H.felis疫苗實(shí)驗(yàn)Czinn等(1993)將H.felis的超聲波粉碎提取抗原與CT經(jīng)口投予無菌小鼠,確證血中,、胃粘膜和腸粘膜中IgA,、IgG抗體明顯上升后,過7～10天經(jīng)口感染以H.felis活菌,結(jié)果免疫組僅4/17只受染,而對(duì)照組有14/18只受染,說明免疫組動(dòng)物確實(shí)獲得預(yù)防感染效果。
細(xì)菌熱休克蛋白是在大多數(shù)微生物感染過程中產(chǎn)生的一組對(duì)細(xì)菌具有保護(hù)作用的膜相關(guān)蛋白,，是1974年Tissieres等人在研究溫度急劇升高后,，果蠅各種細(xì)胞蛋白質(zhì)合成所發(fā)生的變化時(shí)首先發(fā)現(xiàn)。后來還發(fā)現(xiàn),，不僅熱刺激,，而且其他因素,，如化學(xué)毒物的刺激，也能誘導(dǎo)細(xì)胞合成此類蛋白質(zhì),，并發(fā)生某些變化,，是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的產(chǎn)物，故熱休克蛋白也稱為應(yīng)激蛋白,。幽門螺桿菌合成的熱休克蛋白已鑒定的有Hsp10,、Hsp10、Hsp10,。在我國(guó),，李明峰等人已經(jīng)克窿和表達(dá) 了幽門螺桿菌熱休克蛋白Hsp10，了解了它們對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和分泌的作用?，F(xiàn)在認(rèn)為Hsp10在細(xì)菌的致病機(jī)制中起著重要的作用,，如它可介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)、介導(dǎo)病原與宿主間的識(shí)別和黏附,。Huesea等研究表明,，當(dāng)幽門螺桿菌在模擬胃內(nèi)環(huán)境的低pH環(huán)境中時(shí)，Hp與其受體分子的結(jié)合特性會(huì)發(fā)生明顯的變化,，由于和Hp的Hsp70是受酸而不是耐熱的,，故它們提出了Hp與胃黏膜黏附的雙受體模型，即胃內(nèi)的低pH環(huán)境上調(diào)Hsp70的表達(dá),，表達(dá)的Hsp70呈現(xiàn)到細(xì)菌表面介導(dǎo)Hp與黏附層的硫苷脂結(jié)合：Hp穿過黏膜后再發(fā)生隨后的胃上皮受體的結(jié)合,。劉純杰等克窿和表達(dá)了Hsp70基因，實(shí)現(xiàn)了該基因的融合分泌表達(dá)
Hp的致病機(jī)制到目前仍沒有完全明了,，但它應(yīng)該包括適應(yīng)胃內(nèi)環(huán)境,、黏附和致病等環(huán)節(jié)。據(jù)認(rèn)為有多種黏附分子參與了Hp與胃黏膜上皮的黏附過程,，熱休克蛋白（heat shock protein,，hsp）便是其中一種。1998年,，huesca等報(bào)道,，Hp的hsp70是一種可能的介導(dǎo)硫甘脂識(shí)別的黏附分子。為了進(jìn)一步探討Hp hsp70在細(xì)胞黏附中的作用及抗hsp70免疫在機(jī)體防止Hp在胃內(nèi)定居的可能性,，我們擬在真核細(xì)胞中表達(dá)此基因,。
研究前景 DNA疫苗是繼減毒、滅活的全病原體疫苗和基因工程表達(dá)的亞單位疫苗之后的免疫預(yù)防研究領(lǐng)域的第三次革命,。1993年Ulmer等首次以流感病毒的血凝素(HA)抗原的DNA疫苗表達(dá)載體進(jìn)行免疫接種并獲得保護(hù)性免疫應(yīng)答以后,關(guān)于DNA疫苗的研究進(jìn)展迅速,。病毒感染性疾病與腫瘤免疫的應(yīng)答機(jī)制研究表明,之所以會(huì)出現(xiàn)病毒感染的慢性化或針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受,不僅是因?yàn)槿狈碓从诓≡w或腫瘤的有效抗原,而且還因?yàn)檫@些抗原的加工與提呈過程出現(xiàn)異常,因而不能十分有效地刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。如一些慢性乙肝患者體內(nèi)存在著相當(dāng)數(shù)量的乙肝病毒表面抗原(HBsAg),卻又不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)乙肝病毒有效的免疫應(yīng)答,以清除體內(nèi)的乙肝病毒,。目前認(rèn)為肝細(xì)胞雖然是分泌表達(dá)HBsAg的主要細(xì)胞類型,卻不是一種很好的抗原加工與提呈細(xì)胞,。近年來對(duì)于肌肉中的成肌細(xì)胞,、皮膚的樹突狀細(xì)胞進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞是很好的抗原加工與提呈細(xì)胞。肌肉或皮下注射DNA疫苗以后,這些細(xì)胞不僅能夠攝取,、表達(dá)注射的質(zhì)粒DNA,而且在蛋白質(zhì)合成以后,蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)運(yùn)輸與分泌過程中,能夠?qū)τ谶@些抗原成份進(jìn)行加工,并與MHC抗原分子進(jìn)行正確作用與結(jié)合,然后作為一種復(fù)合物形式表達(dá)在細(xì)胞表面,從而成為重要的抗原提呈細(xì)胞,。這就是DNA疫苗研究的主要理論基礎(chǔ)。
關(guān)于抗HSP70疫苗的研制,，目前國(guó)內(nèi)外也主要集中在口服疫苗的構(gòu)建,。然而由于多數(shù)非復(fù)制性的抗原經(jīng)口服后其免疫原性非常弱，不能靶向運(yùn)載至腸到的黏膜免疫系統(tǒng),，同時(shí)抗原容易被消化和降解,，且胃腸的吸收率很低，無法刺激有效的免疫應(yīng)答,。DNA疫苗是將編碼免疫原的基因插入細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒,，直接接種重組質(zhì)粒，后者在體內(nèi)表達(dá)并誘導(dǎo)免疫保護(hù)應(yīng)答的抗原,。其優(yōu)點(diǎn)為：簡(jiǎn)便,，無需體外表達(dá)、純化抗原和應(yīng)用佐劑,?？稍隗w內(nèi)持續(xù)表達(dá)，從而可持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免役應(yīng)答,，免疫效果好,。能夠克服其它疫苗很多缺點(diǎn)，具有很好的發(fā)展前途,。我們擬構(gòu)建hsp70DNA疫苗,，并在真核細(xì)胞上表達(dá)hsp70，將表達(dá)hsp70的真核細(xì)胞免疫家兔,，測(cè)家兔血清抗hsp70效價(jià),。
目前防治Hp的手段主要是抗生素的應(yīng)用，但由于該菌產(chǎn)生耐藥性,，使得抗菌療法日益受到限制，因此尋找有效的,、安全的Hp疫苗顯得十分重要,。目前，關(guān)于hsp70的國(guó)內(nèi)外研究主要集中在原核生物上的表達(dá)及其功能方面的研究,。對(duì)于hsp70在真核生物上的表達(dá),，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道，對(duì)于抗hsp70 DNA疫苗的研制,，更鮮有報(bào)道,。由于hsp70在原核生物的表達(dá)有其固有的缺陷性,，表達(dá)產(chǎn)物是沒有活性的包涵體。所以應(yīng)用價(jià)值不大,。本研究以真核細(xì)胞為表達(dá)載體,，實(shí)現(xiàn)hsp70在真核生物上的表達(dá)，并直接用裸DNA肌肉注射免疫家兔,，獲得一定的免疫反應(yīng),，為通過基因疫苗的方法防治Hp感染提供新的手段。
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