生物谷報(bào)道：g-氨基丁酸(GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),，在體內(nèi)通過作用于離子通道型的GABAA,、GABAC受體及代謝型的GABAB受體而發(fā)揮生理功能。GABAB 受體存在于神經(jīng)元的突觸前及突觸后部位,，介導(dǎo)慢的抑制性效應(yīng),，在腦內(nèi)參與許多重要的生理活動(dòng)和病理變化，包括認(rèn)知損害,、癲癇,、痙攣及藥物成癮等。GABAB受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的C家族,，具有七次跨膜結(jié)構(gòu),，N-端位于胞外，C-端位于胞內(nèi),。GABAB受體有兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域——胞外的捕蠅草模塊(VFT,，負(fù)責(zé)與GABA結(jié)合)及七次螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域 (HD，負(fù)責(zé)G蛋白的激活),。位于突觸前的GABAB受體被激活后,，主要通過偶聯(lián)Gi/o-型蛋白而阻滯鈣通道，減少鈣內(nèi)流,，抑制興奮性遞質(zhì)的釋放,；位于突觸后膜的GABAB受體被激活后，可通過G蛋白偶聯(lián)增強(qiáng)鉀電導(dǎo),，增加鉀外流,。GABAB受體還可影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的水平及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和cAMP反應(yīng)原件連接蛋白(CREB)的磷酸化,。功能狀態(tài)的GABAB受體是由GB1和GB2形成的異源二聚體，GB1可與GABA結(jié)合,，但它不能激活G蛋白,，不僅如此，單獨(dú)表達(dá)的GB1由于C-端存在胞內(nèi)滯留信號(IRS)而不能定位至細(xì)胞膜,；相反,，GB2在與GB1形成二聚體后可激活G蛋白，但它沒有結(jié)合GABA的能力,；GB2還可增強(qiáng)激動(dòng)劑與GB1的親和力,，并且通過與GB1形成二聚體結(jié)構(gòu)而屏蔽GB1的胞內(nèi)滯留信號，使其能定位至細(xì)胞膜,。但迄今為止,，細(xì)胞膜上GABAB受體的寡聚化對受體激活的影響還了解的不清楚。
ABPP (Activity-based protein profiling) 技術(shù)是運(yùn)用化學(xué)合成的具有高選擇性的分子探針(activity-based probe,，ABP)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行研究的新型技術(shù),。它整合了生物學(xué)和化學(xué)學(xué)科的各自優(yōu)勢，以一種相對簡單明了的方法在分子,、細(xì)胞水平研究活性小分子與生物大分子之間的復(fù)雜相互作用,，從而從分子水平揭示生物體在生理或病理狀態(tài)下的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制。ABPP技術(shù)目前應(yīng)用于對重要藥物靶點(diǎn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究的主要方法之一,。
為了研究GABAB受體在細(xì)胞中的定位及功能,，中國科學(xué)院上海藥物研究所研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)已知的GB1強(qiáng)親和力、高選擇性的拮抗劑CGP64213設(shè)計(jì)合成了活性導(dǎo)向的光親和標(biāo)記熒光探針分子probe 1,，并用該探針探討了過表達(dá)GABAB受體的CHO細(xì)胞中GABAB受體的細(xì)胞定位情況,。Probe 1的結(jié)構(gòu)包括3個(gè)功能部分：活性基團(tuán),，即與CGP64213結(jié)構(gòu)相同的部分,，這部分結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)與受體蛋白結(jié)合；三氟甲基偶氮烯光親和標(biāo)記基團(tuán),，負(fù)責(zé)在探針分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合后,，通過紫外光照射在二者間引入共價(jià)鍵，增加標(biāo)記的效率,；BODIPY熒光基團(tuán),，方便被標(biāo)記蛋白的檢測?；钚詼y試的結(jié)果表明,，probe 1因保持了CGP64213結(jié)構(gòu)中對活性至關(guān)重要的部分而相應(yīng)的保持了與GABAB受體的親和力。由于二者之間的親和力,，probe 1可與GABAB受體特異性結(jié)合,，紫外光照射活化探針分子中的光標(biāo)記基團(tuán)后可在二者之間引入共價(jià)鍵,，受體蛋白被標(biāo)記，通過探針分子結(jié)構(gòu)中的熒光基團(tuán),，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)下對GABAB受體的定位觀測,。熒光成像實(shí)驗(yàn)表明，probe 1在過表達(dá)GABAB受體的CHO細(xì)胞中特異性標(biāo)記表達(dá)于細(xì)胞表面的GB1,，這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的CGP64213是GB1選擇性的拮抗劑相吻合,。不僅如此，實(shí)驗(yàn)表明probe 1標(biāo)記的特異性依賴于其結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán),，因?yàn)槿笔ЫY(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)將導(dǎo)致探針分子標(biāo)記能力的喪失,。同時(shí)，CGP64213預(yù)處理過的細(xì)胞將不能被probe 1標(biāo)記,，說明 probe 1不僅保持了CGP64213的活性,，而且保持了其與受體蛋白間的作用模式。光親和標(biāo)記基團(tuán)的引入對于提高標(biāo)記的效率起了重要的作用,，因?yàn)槿粼跇?biāo)記實(shí)驗(yàn)中省略光照射步驟,，即不在探針分子與結(jié)合的受體蛋白間引入共價(jià)鍵，將導(dǎo)致觀察到的熒光信號的明顯減弱,。 這些結(jié)果為利用小分子探針實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞中處于功能狀態(tài)的GABAB受體的動(dòng)態(tài)研究以及利用活性導(dǎo)向的蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)研究膜受體提供了可行性,。
該研究工作由上海藥物所南發(fā)俊課題組和華中科技大學(xué)生命科學(xué)院劉劍峰教授課題組合作完成。論文以Letter形式發(fā)表在《醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志》（Journal of Medicinal Chemistry） 上,。（生物谷www.bioon.com）
生物谷推薦原始出處：
Journal of Medicinal Chemistry,，51 (11), 3057–3060，Jian-Feng Liu,，F(xiàn)a-Jun Nan
Activity-Based Probe for Specific Photoaffinity Labeling γ-Aminobutyric Acid B (GABAB) Receptors on Living Cells: Design, Synthesis, and Biological Evaluation
Xin Li,‡§ Jian-Hua Cao,†§ Ying Li,†§ Philippe Rondard,# Yang Zhang,† Ping Yi,† Jian-Feng Liu,*† and Fa-Jun Nan*‡
Key Laboratory of Molecular Biophysics of Ministry of Education, School of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 1037 Luo Yu Road, Wuhan, Hubei, China, National Center for Drug Screening, State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 189 Guo Shou Jing Road, Shanghai 201203, China, and Institute of Functional Genomics, CNRS UMR5203, INSERM U661, University of Montpellier 1 and 2, Montpellier, F-34094, France
Abstract:
A trimodular activity-based probe was designed, synthesized, characterized, and applied to photoaffinity label the GABAB receptors transiently expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells. The probe exhibits specific binding activity at the ligand-binding pocket of GB1 subunits and high specificity of photoaffinity labeling, which makes the probe valuable for studying the localization and function of GABAB receptors on living cells.
