來自瑞士蘇黎世大學分子生命科學研究所、蘇黎世理工學院分子系統(tǒng)生物學研究所,、蘇黎世系統(tǒng)生理學和代謝疾病合作中心,、瑞士弗雷德里希米歇爾生物醫(yī)藥研究所、英國劍橋大學生物化學系,、英國劍橋大學威康信托/英國格登癌癥研究所及蘇黎世大學理學院等多家研究單位發(fā)明的一種大尺度鑒定miRNA靶點新方法,。Nature Methods網絡版9月12日在線出版了該新方法,。
在過去幾年中，隨著實驗和計算方法的發(fā)展和完善,，miRNA靶點的鑒定和預測研究取得很大進展,。然而，全面正確地鑒定miRNA的生物學相關靶點依然是個難點,。恩加特納研究組發(fā)明了一種叫做“選擇性反應監(jiān)測”（selected reaction monitoring,，SRM）的方法，該方法利用有針對性的質譜技術實現(xiàn)了對miRNA-靶點互作的大尺度蛋白組學分析,，進而對預測的靶點進行驗證,。
恩加特納等人利用線蟲let-7突變體及其野生型為實驗材料。為了測定由于let-7突變體數量減少導致的蛋白含量的下降,，恩加特納等人對感興趣的let-7突變體和野生型的蛋白提取物進行化學標記,，之后對其進行SRM質譜分析，獲得了可靠的目標蛋白的定量數據,。該實驗使用了一套let-7可能的靶點基因及一套對照基因。結果發(fā)現(xiàn),，161個蛋白中的29個蛋白的表達含量在突變體中發(fā)生變化,，這可能是由于let-7基因和不同的靶點互作結果——該結果得到了獨立下游實驗包括遺傳互作、多聚核糖體分析和熒光素酶檢測的驗證,。
SRM技術可以作為一個驗證工具來進一步探討對于靶點的理解,；此外，SRM也可能用來精細描述目標蛋白質組亞群,，促進miRNA生物功能模型的研究,。（生物谷Bioon.com）
生物谷推薦英文摘要：
Nature Methods doi:10.1038/nmeth.1504
A quantitative targeted proteomics approach to validate predicted microRNA targets in C. elegans
Marko Jovanovic1,2,3,11, Lukas Reiter1,2,3,10,11, Paola Picotti4, Vinzenz Lange4,5,10, Erica Bogan1,2, Benjamin A Hurschler6, Cherie Blenkiron7,8,10, Nicolas J Lehrbach7,8, Xavier C Ding6, Manuel Weiss1,2,3, Sabine P Schrimpf1,3, Eric A Miska7,8, Helge Gro?hans6, Ruedi Aebersold4,5,9 & Michael O Hengartner1,3
Efficient experimental strategies are needed to validate computationally predicted microRNA (miRNA) target genes. Here we present a large-scale targeted proteomics approach to validate predicted miRNA targets in Caenorhabditis elegans. Using selected reaction monitoring (SRM), we quantified 161 proteins of interest in extracts from wild-type and let-7 mutant worms. We demonstrate by independent experimental downstream analyses such as genetic interaction, as well as polysomal profiling and luciferase assays, that validation by targeted proteomics substantially enriched for biologically relevant let-7 interactors. For example, we found that the zinc finger protein ZTF-7 was a bona fide let-7 miRNA target. We also validated predicted miR-58 targets, demonstrating that this approach is adaptable to other miRNAs. We propose that targeted mass spectrometry can be applied generally to validate candidate lists generated by computational methods or in large-scale experiments, and that the described strategy should be readily adaptable to other organisms.
