六,、制備探針

    分離RNA：我們成功嘗試了各種方法制備的RNA，包括熱酚抽提,、異硫氰酸胍穩(wěn)定及其它方法等,，這些方法已在別處綜述過(guò)，就不在此贅述了,。我們也成功嘗試了Invitrogen的FastTrak 2.0 mRNA isolation kits (Invitrogen K1593-02),，用于抽提人和酵母的樣品。主要判定指標(biāo)為產(chǎn)出高質(zhì)量的RNA,。對(duì)基因表達(dá)研究來(lái)說(shuō),，最好的結(jié)果是用poly-dA RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，盡管,，至少對(duì)酵母菌來(lái)說(shuō),，用總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板也取得了好結(jié)果。一個(gè)好實(shí)驗(yàn)對(duì)每種標(biāo)本需要至少1µg(越多越好)polyA RNA(或100µg總RNA)以用作合成熒光標(biāo)記cDNA探針的模板,。擴(kuò)增小量RNA的方法正在嘗試之中,， 與在這討論的方法進(jìn)行比較。
    標(biāo)記：已有許多方法用于從RNA制備標(biāo)記探針,。在多數(shù)情況下,，我們直接在oligo-dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)標(biāo)記cDNA。在某些條件下,，用隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成也可用于標(biāo)記,，盡管此方法不是對(duì)所有微陣列設(shè)計(jì)都適用。例如,，由3’端序列組成的微陣列更適用于oligo-dT反轉(zhuǎn)錄的cDNA探針，由完整cDNA序列或含預(yù)測(cè)開放閱讀框架序列構(gòu)成的微陣列對(duì)兩種逆轉(zhuǎn)錄方法都適用,。樣品還可在未標(biāo)記的第一鏈合成后進(jìn)行第二鏈合成時(shí)再標(biāo)記,。以下列出三種方法。
    熒光染料：很多熒光染料標(biāo)記的雙脫氧核苷酸可由商業(yè)渠道取得,。出色的結(jié)果是用Cy3-和Cy5-dUTP獲得,，兩者激發(fā)光譜分得很開，用多種酶均可獲得特異活性摻入,，干燥后就可激發(fā)熒光,，從而簡(jiǎn)化了圖象獲取過(guò)程,。我們?nèi)〉昧己媒Y(jié)果的其它熒光染料包括R110 (Perkin Elmer)、TAMRA (Perkin Elmer)和SpectrumOrange(Vysis),。
    oligo-dT和隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記：所有試劑應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌及DEPC處理,。RNA溶于10µl水中，該溶液應(yīng)包括一些對(duì)照RNA(參見本文后半部分),。加2.5µl(6µg)引物(20-mer oligo-dT,，anchored oligo-dT，random hexamer或random nonamer：2.5µg/µl,，用水配制),。70°C水浴10分鐘以變性RNA，放于冰上,。將下列試劑混合：2µl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL SuperScriptII Rnase H- Reverse Transcriptase kit; 目錄號(hào) 18064-014),，6µl 5×first-strand buffer (SuperScript kit; 250mM Tris-HCl， pH 8.3,， 375 mM KCl,， 15 mM MgCl2)， 3µl 0.1 M DTT(也在試劑盒中),， 6µl 5×nucleotides (2.5 mM dATP,，2.5 mM dCTP，2.5 mM dGTP,，1.0 mM dTTP),，3µl 1mM Cy3或Cy5標(biāo)記的dUTPs (Amersham)。上述混合液加入RNA-引物溶液,，終體積為30µl,，42°C保溫1小時(shí)。加入1µl SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶,，42°C再保溫1小時(shí),。加1.5µl 20mM EDTA以終止反應(yīng)，加入15µl 0.1M NaOH降解模板RNA,，70°C孵育10分鐘,，立即加入15µl 0.1M HCL以中和樣品(熒光染料，尤其是Cy5對(duì)高PH敏感),。將樣品放入Microcon30微濃縮器(Amicon),，并加入500µl TE (10 mM Tris，pH 8.0,，1 mM EDTA),，在臺(tái)式離心機(jī)上高速離心5-10分鐘，以調(diào)整體積至10-20µl,，棄流出液,，加500µl TE,，再次離心。二次離心后,，Microcon滯存的探針應(yīng)顯著比流出液清亮,。這一個(gè)成功標(biāo)記反應(yīng)的非常有力的指示現(xiàn)象。如果沒有一點(diǎn)顏色滯存,，標(biāo)記反應(yīng)就不太可能產(chǎn)生好的染交結(jié)果,。將離心柱反轉(zhuǎn)，再離心1分鐘,，以收集探針,，將Cy3、Cy5標(biāo)記的探針混合,，并TE調(diào)整體積至500µl,，用離心柱調(diào)整體積至8µl(到此，顏色應(yīng)顯紫色),。加2µl封閉液,，封閉液含10g/µl 20-mer oligo-dA，10µg /µl yeast tRNA以及10µg/µl human cot-1 DNA (用于人探針時(shí),，GibcoBRL目錄號(hào)15279-011),。加入2.1µl 20×SSC(終濃度為3.5×)和0.4µl 10%SDS(終濃度為0.3%)。注意加SDS時(shí),，槍頭外壁不應(yīng)有SDS,，因?yàn)檫^(guò)多SDS會(huì)對(duì)雜交反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)影響。將樣品放入100°C水浴1分鐘,，以變性樣品,。該樣品應(yīng)在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上自然冷卻。對(duì)人樣品,，應(yīng)在室溫下放置30分鐘,，以允許cot-1酶切DNA片段與重復(fù)序列雜交，對(duì)酵母樣品來(lái)說(shuō),，樣品一旦冷卻下來(lái)即可用于雜交反應(yīng)了,。對(duì)雜交面積為2cm×2cm的陣列來(lái)說(shuō)，雜交液體積適宜用12µl,，雜交面積越大,，也就需要更大體積的雜交液。
    用Klenow酶標(biāo)記cDNA：用以上方法制備cDNA模板,，唯一例外之處是5×核苷酸溶液中的每種dNTP濃度為2.5mM(即逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中每種dNTP的終濃度均為0.5mM)，不含熒光染料標(biāo)記的核苷酸,。按前述方法調(diào)節(jié)樣品至終體積20µl,，加入3µl隨機(jī)引物(hexamer或nonamer,，4µg/µl)，100°C變性1分鐘,，置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上冷卻5分鐘,。加入5µl 10× buffer (100mM Tris-HCl， pH 7.4,， 50 mM MgCl2,， 75 mM DTT)， 5µl 10× nucleotides (0.25 mM dATP,，0.25 mM dCTP,，0.25 mM cGTP，0.09 mM dTTP),，1.5µl 1mM Cy3或Cy5 dUTP(Amersham),，2µl(10U)無(wú)外切酶活性的Klenow酶(USB，目錄號(hào)E700572),，13.5µl ddH2O至終體積50µl,。37°C溫育4小時(shí)。按前述方法純化樣品并準(zhǔn)備雜交,。

七,、雜交

    用臺(tái)式離心機(jī)將探針樣品高速離心1分鐘，以沉淀任何可能的雜質(zhì),。用移液槍將樣品吸加到陣列中央,，注意不要碰到離心管中任何沉淀并避免形成氣泡。封蓋玻片(要足夠大以覆蓋整個(gè)陣列雜交區(qū)表面),，注意不要形成氣泡,。在該玻片的另一區(qū)域滴加5µl 3×SSC，以提供雜交艙內(nèi)濕度,，由此可以確保雜交過(guò)程中探針混合物不會(huì)蒸干,。將玻片放入封口的雜交艙中，并浸入65°C水浴,，4-6小時(shí),。

八、雜交后處理

    雜交后,，小心擦干雜交艙并移出玻片,，浸入盛有洗液1(2×SSC，0.1%SDS)的玻片槽中,，玻片點(diǎn)樣面朝下,，這樣當(dāng)蓋玻片掉落時(shí)不會(huì)劃傷陣列表面。剝落蓋玻片后,，將玻片在洗液中晃動(dòng)2-3次后移入盛有洗液2(1×SSC)的玻片槽中,，小心操作,，盡可能減少洗液1混入玻片槽2中，因?yàn)镾DS會(huì)干擾玻片圖象質(zhì)量,。輕柔搖晃玻片槽2分鐘,，將玻片移入盛有洗液3(0.2×SSC)2分鐘，然后離心甩干玻片,。所有洗液溫度均應(yīng)為室溫,。改變這些步驟的溫度和時(shí)間會(huì)改變雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性。

九,、參照

由于微陣列試驗(yàn)的高平行性,，所以在每張陣列反應(yīng)中加入多種參照物是可能的而且是很有價(jià)值的。下面將描述一些有用的參照,。
    摻入RNA：在探針制備過(guò)程的各個(gè)階段加入已知量的參照RNA,，對(duì)檢測(cè)和評(píng)價(jià)每次實(shí)驗(yàn)的各個(gè)方面是非常有用的。很明顯,，選用的摻入RNA不應(yīng)與待研究的有機(jī)體的RNA有交叉雜交,，但兩者總體特性應(yīng)相近(GC含量、長(zhǎng)度,、poly-A尾巴),。許多酵母菌基因可以在人基因表達(dá)陣列上用作參照，因?yàn)閮烧咴诤塑账崴降耐葱院苡邢?。將上百個(gè)這樣的基因點(diǎn)于人的基因陣列上只是顯著增加了點(diǎn)樣時(shí)間,。將這些基因克隆到帶有噬菌體RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和人造poly-A尾巴的質(zhì)粒上，就可以制備用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)階段的參照基因的大量RNA,。此類參照可用于各個(gè)方面,，例如，參照RNA可以按不同比例或以不同總濃度摻入Cy3,、Cy5標(biāo)記反應(yīng),，由此可以測(cè)定雜交嚴(yán)謹(jǐn)性、輸入比和輸出比的校正以及檢測(cè)靈敏度,。

    RNA質(zhì)量參照：某一類型核酸與互補(bǔ)靶基因結(jié)合的量與互補(bǔ)序列長(zhǎng)度有關(guān),。所以某一給定cDNA的雜交信號(hào)強(qiáng)度隨RNA質(zhì)量好壞而不同。這會(huì)導(dǎo)致不能理解的微陣列雜交結(jié)果,，例如,，用不同質(zhì)量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于雜交時(shí)，會(huì)看到ratio值明顯不相同,。謹(jǐn)慎選擇靶基因序列可使這個(gè)問題的影響最小化,。對(duì)oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，如果靶基因序列局限在3’端，則對(duì)RNA質(zhì)量最不敏感,。RNA質(zhì)量可由相應(yīng)參照物方便地檢測(cè),，例如疊瓦式覆蓋整個(gè)基因的長(zhǎng)度為100-200bp的一組DNA片段可以用于測(cè)定待比較樣品中的RNA相對(duì)質(zhì)量，而降解RNA及由oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的cDNA于5’序列含量較多的基因雜交會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)比例的弱信號(hào),。制備疊瓦式基因片段作為參照，在RNA和探針制備的各個(gè)階段摻入進(jìn)去,，例如,，收獲細(xì)胞時(shí)、分離poly-A RNA時(shí),、探針標(biāo)記時(shí)以及雜交前,，由此可以鑒定設(shè)計(jì)RNA質(zhì)量問題的實(shí)驗(yàn)步驟。
    封閉參照：如前所述,，由于探針和靶基因之間存在非基因特異性的相似性,，尤其是由重復(fù)序列引致的，大多數(shù)雜交反應(yīng)需加入冷DNA進(jìn)行封閉,。與此類潛在的混淆序列相應(yīng)的參照靶基因可用于檢測(cè)封閉是否成功,。例如，如果重復(fù)序列被成功封閉,，在人類基因表達(dá)陣列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因點(diǎn)應(yīng)產(chǎn)生極弱或甚至陰性信號(hào),。其它有用的陰性參照包括oligo-dA、oligo-dT,、質(zhì)粒DNA和人基因組DNA,。
    歸一化參照：對(duì)多個(gè)樣品來(lái)說(shuō)，很難準(zhǔn)確制備完全等量的參照mRNA標(biāo)記探針,，所以加入一些預(yù)期在相互比較的2個(gè)樣品中的雜交信號(hào)一致的參照基因是非常有用的,。例如，對(duì)酵母菌表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō),，酵母菌總基因組DNA制備的靶基因可用于校正兩樣品間的信號(hào),，而人基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的校正更復(fù)雜，由于只有一小部分基因組是表達(dá)的,，人總基因組DNA雜交信號(hào)應(yīng)該非常低,。