六,、制備探針

    分離RNA：我們成功嘗試了各種方法制備的RNA,，包括熱酚抽提、異硫氰酸胍穩(wěn)定及其它方法等,，這些方法已在別處綜述過,，就不在此贅述了。我們也成功嘗試了Invitrogen的FastTrak 2.0 mRNA isolation kits (Invitrogen K1593-02),，用于抽提人和酵母的樣品,。主要判定指標為產(chǎn)出高質(zhì)量的RNA。對基因表達研究來說,，最好的結(jié)果是用poly-dA RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板,，盡管，至少對酵母菌來說,，用總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板也取得了好結(jié)果,。一個好實驗對每種標本需要至少1µg(越多越好)polyA RNA(或100µg總RNA)以用作合成熒光標記cDNA探針的模板。擴增小量RNA的方法正在嘗試之中,， 與在這討論的方法進行比較,。
    標記：已有許多方法用于從RNA制備標記探針。在多數(shù)情況下,，我們直接在oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應時標記cDNA,。在某些條件下，用隨機引物進行cDNA合成也可用于標記,，盡管此方法不是對所有微陣列設(shè)計都適用,。例如，由3’端序列組成的微陣列更適用于oligo-dT反轉(zhuǎn)錄的cDNA探針,，由完整cDNA序列或含預測開放閱讀框架序列構(gòu)成的微陣列對兩種逆轉(zhuǎn)錄方法都適用,。樣品還可在未標記的第一鏈合成后進行第二鏈合成時再標記,。以下列出三種方法。
    熒光染料：很多熒光染料標記的雙脫氧核苷酸可由商業(yè)渠道取得,。出色的結(jié)果是用Cy3-和Cy5-dUTP獲得,，兩者激發(fā)光譜分得很開，用多種酶均可獲得特異活性摻入,，干燥后就可激發(fā)熒光,，從而簡化了圖象獲取過程。我們?nèi)〉昧己媒Y(jié)果的其它熒光染料包括R110 (Perkin Elmer),、TAMRA (Perkin Elmer)和SpectrumOrange(Vysis),。
    oligo-dT和隨機引物逆轉(zhuǎn)錄標記：所有試劑應經(jīng)過滅菌及DEPC處理。RNA溶于10µl水中,，該溶液應包括一些對照RNA(參見本文后半部分),。加2.5µl(6µg)引物(20-mer oligo-dT，anchored oligo-dT,，random hexamer或random nonamer：2.5µg/µl,，用水配制)。70°C水浴10分鐘以變性RNA,，放于冰上,。將下列試劑混合：2µl MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL SuperScriptII Rnase H- Reverse Transcriptase kit; 目錄號 18064-014)，6µl 5×first-strand buffer (SuperScript kit; 250mM Tris-HCl,， pH 8.3,， 375 mM KCl， 15 mM MgCl2),， 3µl 0.1 M DTT(也在試劑盒中),， 6µl 5×nucleotides (2.5 mM dATP，2.5 mM dCTP,，2.5 mM dGTP,，1.0 mM dTTP)，3µl 1mM Cy3或Cy5標記的dUTPs (Amersham),。上述混合液加入RNA-引物溶液,，終體積為30µl，42°C保溫1小時,。加入1µl SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶,，42°C再保溫1小時,。加1.5µl 20mM EDTA以終止反應,，加入15µl 0.1M NaOH降解模板RNA，70°C孵育10分鐘,，立即加入15µl 0.1M HCL以中和樣品(熒光染料,，尤其是Cy5對高PH敏感),。將樣品放入Microcon30微濃縮器(Amicon)，并加入500µl TE (10 mM Tris,，pH 8.0,，1 mM EDTA)，在臺式離心機上高速離心5-10分鐘,，以調(diào)整體積至10-20µl,，棄流出液，加500µl TE,，再次離心,。二次離心后，Microcon滯存的探針應顯著比流出液清亮,。這一個成功標記反應的非常有力的指示現(xiàn)象,。如果沒有一點顏色滯存，標記反應就不太可能產(chǎn)生好的染交結(jié)果,。將離心柱反轉(zhuǎn),，再離心1分鐘，以收集探針,，將Cy3,、Cy5標記的探針混合，并TE調(diào)整體積至500µl,，用離心柱調(diào)整體積至8µl(到此,，顏色應顯紫色)。加2µl封閉液,，封閉液含10g/µl 20-mer oligo-dA,，10µg /µl yeast tRNA以及10µg/µl human cot-1 DNA (用于人探針時，GibcoBRL目錄號15279-011),。加入2.1µl 20×SSC(終濃度為3.5×)和0.4µl 10%SDS(終濃度為0.3%),。注意加SDS時，槍頭外壁不應有SDS,，因為過多SDS會對雜交反應產(chǎn)生負影響,。將樣品放入100°C水浴1分鐘，以變性樣品,。該樣品應在實驗臺上自然冷卻,。對人樣品，應在室溫下放置30分鐘,，以允許cot-1酶切DNA片段與重復序列雜交,，對酵母樣品來說，樣品一旦冷卻下來即可用于雜交反應了。對雜交面積為2cm×2cm的陣列來說,，雜交液體積適宜用12µl,，雜交面積越大，也就需要更大體積的雜交液,。
    用Klenow酶標記cDNA：用以上方法制備cDNA模板,，唯一例外之處是5×核苷酸溶液中的每種dNTP濃度為2.5mM(即逆轉(zhuǎn)錄反應中每種dNTP的終濃度均為0.5mM)，不含熒光染料標記的核苷酸,。按前述方法調(diào)節(jié)樣品至終體積20µl,，加入3µl隨機引物(hexamer或nonamer，4µg/µl),，100°C變性1分鐘,，置實驗臺上冷卻5分鐘。加入5µl 10× buffer (100mM Tris-HCl,， pH 7.4,， 50 mM MgCl2， 75 mM DTT),， 5µl 10× nucleotides (0.25 mM dATP,，0.25 mM dCTP，0.25 mM cGTP,，0.09 mM dTTP),，1.5µl 1mM Cy3或Cy5 dUTP(Amersham)，2µl(10U)無外切酶活性的Klenow酶(USB,，目錄號E700572),，13.5µl ddH2O至終體積50µl。37°C溫育4小時,。按前述方法純化樣品并準備雜交,。

七、雜交

    用臺式離心機將探針樣品高速離心1分鐘,，以沉淀任何可能的雜質(zhì),。用移液槍將樣品吸加到陣列中央，注意不要碰到離心管中任何沉淀并避免形成氣泡,。封蓋玻片(要足夠大以覆蓋整個陣列雜交區(qū)表面),，注意不要形成氣泡。在該玻片的另一區(qū)域滴加5µl 3×SSC,，以提供雜交艙內(nèi)濕度,，由此可以確保雜交過程中探針混合物不會蒸干。將玻片放入封口的雜交艙中,，并浸入65°C水浴,，4-6小時。

八、雜交后處理

    雜交后,，小心擦干雜交艙并移出玻片，浸入盛有洗液1(2×SSC,，0.1%SDS)的玻片槽中,，玻片點樣面朝下，這樣當蓋玻片掉落時不會劃傷陣列表面,。剝落蓋玻片后,，將玻片在洗液中晃動2-3次后移入盛有洗液2(1×SSC)的玻片槽中，小心操作,，盡可能減少洗液1混入玻片槽2中,，因為SDS會干擾玻片圖象質(zhì)量。輕柔搖晃玻片槽2分鐘,，將玻片移入盛有洗液3(0.2×SSC)2分鐘,，然后離心甩干玻片。所有洗液溫度均應為室溫,。改變這些步驟的溫度和時間會改變雜交的嚴謹性,。

九、參照

由于微陣列試驗的高平行性,，所以在每張陣列反應中加入多種參照物是可能的而且是很有價值的,。下面將描述一些有用的參照。
    摻入RNA：在探針制備過程的各個階段加入已知量的參照RNA,，對檢測和評價每次實驗的各個方面是非常有用的,。很明顯，選用的摻入RNA不應與待研究的有機體的RNA有交叉雜交,，但兩者總體特性應相近(GC含量,、長度、poly-A尾巴),。許多酵母菌基因可以在人基因表達陣列上用作參照,，因為兩者在核苷酸水平的同源性很有限。將上百個這樣的基因點于人的基因陣列上只是顯著增加了點樣時間,。將這些基因克隆到帶有噬菌體RNA聚合酶結(jié)合位點和人造poly-A尾巴的質(zhì)粒上,，就可以制備用于各個實驗階段的參照基因的大量RNA。此類參照可用于各個方面,，例如,，參照RNA可以按不同比例或以不同總濃度摻入Cy3、Cy5標記反應,，由此可以測定雜交嚴謹性,、輸入比和輸出比的校正以及檢測靈敏度。

    RNA質(zhì)量參照：某一類型核酸與互補靶基因結(jié)合的量與互補序列長度有關(guān)。所以某一給定cDNA的雜交信號強度隨RNA質(zhì)量好壞而不同,。這會導致不能理解的微陣列雜交結(jié)果,，例如，用不同質(zhì)量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于雜交時,，會看到ratio值明顯不相同,。謹慎選擇靶基因序列可使這個問題的影響最小化。對oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄的cDNA,，如果靶基因序列局限在3’端,，則對RNA質(zhì)量最不敏感。RNA質(zhì)量可由相應參照物方便地檢測,，例如疊瓦式覆蓋整個基因的長度為100-200bp的一組DNA片段可以用于測定待比較樣品中的RNA相對質(zhì)量,，而降解RNA及由oligo-dT逆轉(zhuǎn)錄標記的cDNA于5’序列含量較多的基因雜交會產(chǎn)生相應比例的弱信號。制備疊瓦式基因片段作為參照,，在RNA和探針制備的各個階段摻入進去,，例如，收獲細胞時,、分離poly-A RNA時,、探針標記時以及雜交前，由此可以鑒定設(shè)計RNA質(zhì)量問題的實驗步驟,。
    封閉參照：如前所述,，由于探針和靶基因之間存在非基因特異性的相似性，尤其是由重復序列引致的,，大多數(shù)雜交反應需加入冷DNA進行封閉,。與此類潛在的混淆序列相應的參照靶基因可用于檢測封閉是否成功。例如,，如果重復序列被成功封閉,，在人類基因表達陣列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因點應產(chǎn)生極弱或甚至陰性信號。其它有用的陰性參照包括oligo-dA,、oligo-dT,、質(zhì)粒DNA和人基因組DNA。
    歸一化參照：對多個樣品來說,，很難準確制備完全等量的參照mRNA標記探針,，所以加入一些預期在相互比較的2個樣品中的雜交信號一致的參照基因是非常有用的。例如,，對酵母菌表達實驗來說,，酵母菌總基因組DNA制備的靶基因可用于校正兩樣品間的信號，而人基因表達實驗的校正更復雜,，由于只有一小部分基因組是表達的,，人總基因組DNA雜交信號應該非常低,。