十、掃描玻片和數(shù)據(jù)處理
雜交后應(yīng)獲取針對(duì)實(shí)驗(yàn)所用2種熒光染料的微陣列熒光圖像。我們使用的裝置是激光掃描共聚焦顯微鏡(掃描儀)。掃描儀有一個(gè)激光管(或一組激光管)，可以產(chǎn)生與所用熒光染料激發(fā)光譜相應(yīng)的某一波長(zhǎng)激光。激光穿過(guò)一標(biāo)準(zhǔn)物鏡照亮玻片上的一個(gè)點(diǎn)，激發(fā)熒光被物鏡聚集后又穿過(guò)一系列濾鏡(以去除激發(fā)光波),、一個(gè)校準(zhǔn)透鏡和一個(gè)極小孔眼(以降低噪音，這使得它成為一個(gè)共聚焦裝置),，并在一個(gè)光電倍增管中進(jìn)行計(jì)量,。激光束快速掃描玻片后獲得微陣列的一幅光柵圖像。用一對(duì)galvanometer將光束定位于固定玻片上的各個(gè)點(diǎn),，或用泛光照射源和CCD鏡頭,，也可獲得相似圖像。我們發(fā)現(xiàn)共聚焦掃描裝置所獲結(jié)果最好,，因?yàn)槠湫旁氡葍?yōu)于galvanometer或CCD,。
如前所述，實(shí)驗(yàn)最終目標(biāo)是測(cè)定玻片上每一點(diǎn)的兩種熒光染料的相對(duì)信號(hào)值,。有多種方法可以完成這一任務(wù),，最常見(jiàn)者是將圖像柵格化，然后計(jì)算每方格中每種熒光染料的平均熒光強(qiáng)度,，兩樣品中基因相對(duì)含量就變成了兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值,。這種計(jì)算可能會(huì)受諸如對(duì)大多數(shù)陣列可見(jiàn)到的非零熒光背景進(jìn)行補(bǔ)償計(jì)算的影響。我們開(kāi)發(fā)了相應(yīng)軟件,，可運(yùn)用多種算法準(zhǔn)確估算背景值,，并用更復(fù)雜的算法直接測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度比值,。這個(gè)會(huì)和計(jì)劃中的價(jià)格不貴的共聚焦掃描儀一起面市,。
十一、點(diǎn)樣問(wèn)題
用到DAN微陣列的實(shí)驗(yàn)會(huì)在任一步驟中遇到技術(shù)問(wèn)題,，而由微陣列提供的加入多種內(nèi)參照方法將有助于識(shí)別和校正許多問(wèn)題,。確實(shí),，甚至有嚴(yán)重瑕疵的實(shí)驗(yàn)也常提供足夠多的有用新信息。明智的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是,，只要有可能,，就應(yīng)安排實(shí)驗(yàn)的每一步驟都能重復(fù)而無(wú)需重復(fù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)，例如多準(zhǔn)備些mRNA和玻片陣列,，應(yīng)多于實(shí)際需要量,，這就是聰明之舉。
十全十美的陣列圖像是罕見(jiàn)的,。我們碰到的許多問(wèn)題很難追蹤原因,，而且在陣列掃描之前無(wú)法用可檢測(cè)手段證明這些原因。我們建議在雜交珍貴樣品前設(shè)立多級(jí)質(zhì)量控制,。成批的左旋多聚賴(lài)氨酸修飾玻片應(yīng)加以質(zhì)檢,，可取小量修飾好的玻片進(jìn)行點(diǎn)樣并測(cè)試整個(gè)后處理和雜交過(guò)程。只有小量玻片測(cè)試成功,，同一批次的大量玻片才用于真正的點(diǎn)樣,。一旦玻片點(diǎn)樣后，應(yīng)對(duì)小量點(diǎn)樣玻片進(jìn)行后處理,，后處理是否成功可用已知應(yīng)產(chǎn)生良好結(jié)果的RNA制備的探針進(jìn)行測(cè)試來(lái)判定,。最后，所有陣列在雜交前應(yīng)掃描一次,，棄去那些有明顯污點(diǎn)的玻片(劃傷或任何影響左旋多聚賴(lài)氨酸修飾的因素均可被檢測(cè)為微陣列上的背景熒光),，并棄去那些雜交前背景就高的陣列。左旋多聚賴(lài)氨酸和其它修飾物在對(duì)應(yīng)于Cy3波長(zhǎng)激發(fā)光下會(huì)發(fā)弱熒光,，由于一些未知原因這種熒光在玻片之間有變異,，偶爾強(qiáng)度達(dá)到能干擾雜交信號(hào)。另外,，樣點(diǎn)上的DNA在此激發(fā)波長(zhǎng)下也會(huì)發(fā)出弱熒光且在玻片之間有變異,。如果這些雜交前熒光信號(hào)源中的任一種的強(qiáng)度處于或接近雜交玻片上的信號(hào)，就應(yīng)棄去這些陣列,。以下討論最常見(jiàn)問(wèn)題(見(jiàn)圖5)中的某一些,。
樣點(diǎn)的形狀問(wèn)題：一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題就是部分或所有點(diǎn)有“彗星尾”，任一點(diǎn)的拖尾與其它點(diǎn)的拖尾方向一致,，樣點(diǎn)的顏色也反映在拖尾中,。這一現(xiàn)象可能由于沒(méi)有完全而快速地將玻片浸沒(méi)在Succinic Anhydride封閉液中所致。使從樣點(diǎn)洗脫的DNA又結(jié)合到玻片上,。若拖尾的樣點(diǎn)彼此是分離的,，這些有彗星尾的玻片依然是可用的。與樣點(diǎn)總體外觀有關(guān)的另一現(xiàn)象是“面包圈孔”,。按前述方法用點(diǎn)樣針點(diǎn)樣時(shí),，它并不是留下一個(gè)均一的圓,，較多物質(zhì)滯聚在樣點(diǎn)的外圍部分，就使得中央部分相對(duì)空當(dāng),。這一現(xiàn)象可由延長(zhǎng)再次水合化時(shí)間來(lái)解決,。再次水合化時(shí)間再次延長(zhǎng)些，那么彗星尾,、面包圈孔就不會(huì)讓一張玻片浪費(fèi),，實(shí)際上只是稍稍在數(shù)據(jù)質(zhì)量上作了一點(diǎn)妥協(xié)。
高背景：由于異常的高熒光背景而導(dǎo)致的芯片模糊是常見(jiàn)的問(wèn)題,。高背景即可出現(xiàn)在整個(gè)芯片的雜交表面,，也可出現(xiàn)在一個(gè)局部區(qū)域。我們可以估計(jì)高背景的可能來(lái)源,，但要確切地查明某種高背景的來(lái)源是困難的,。在試圖判斷高背景問(wèn)題時(shí)，弄清高背景在玻片上的位置是十分重要的,。如果在雜交前預(yù)先系統(tǒng)地掃描芯片,，覆蓋整個(gè)芯片的明顯高背景是可以避免的。高背景局限于雜交區(qū),，說(shuō)明標(biāo)記的探針粘著于玻片表面,，在洗片步驟時(shí)沒(méi)有被沖洗掉，導(dǎo)致這一結(jié)果有兩種可能性,，一是poly-lysine的氨基基團(tuán)封閉不足,，或是在雜交中標(biāo)記的探針?lè)翘禺愇健＿@種來(lái)源的高背景通常伴隨著“anti-probe”現(xiàn)象,，此高背景只出現(xiàn)在非樣點(diǎn)區(qū)域,，這很可能反映出這一區(qū)域的poly-lysine容納點(diǎn)片DNA能力降低。在某種情況下,，芯片的一邊背景較差,，提示與玻片在液體媒介（最可能是封閉液）中被如何放置有關(guān)。通常高背景易出現(xiàn)在蓋玻片的邊緣,，可能提示探針在雜交中脫水析出,，這一問(wèn)題可通過(guò)在雜交艙中加多點(diǎn)3× SSC，并確保封好雜交艙而得以解決,。均一的高背景也可能是由于探針制備不好導(dǎo)致,，因?yàn)樾〉奶结樒位虿缓细竦臒晒夂塑战Y(jié)合在表面引起高背景卻不影響雜交信號(hào)。
局部信號(hào)微弱：大部分高背景現(xiàn)象都伴隨特異性信號(hào)減弱,，因?yàn)樘结樀男盘?hào)被芯片表面的高背景所掩蓋,。然而，不伴有高背景的信號(hào)微弱也可能發(fā)生，經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為這是因?yàn)檫@一區(qū)域探針層太薄而引起的,。芯片或／和蓋玻片表面的氣泡和不勻質(zhì)也能引起這種結(jié)果。仔細(xì)選擇和放置玻片與蓋玻片可減少這個(gè)問(wèn)題,。
結(jié)論
MICROARRAY是在基因組范疇內(nèi)進(jìn)行探索,、研究的有力工具。多年來(lái)生物學(xué)家已經(jīng)能研究少量條件下的大量基因或多種條件下少量基因的差異表達(dá),?；蛐酒谝淮问股锨ХN條件下研究成千上萬(wàn)個(gè)基因成為可能。對(duì)于那些基因組序列已知的生物體（如Saccharomyces Cerevisiae）這一技術(shù)使同時(shí)研究其所有基因表達(dá)成為可能,。對(duì)于人類(lèi),，應(yīng)用同樣方法的唯一局限性就是需要已知基因的數(shù)據(jù)；人類(lèi)完整的轉(zhuǎn)錄物鑒定和測(cè)序?qū)⒃谝院髱啄晖瓿?。過(guò)去,，由于實(shí)驗(yàn)工具的局限迫使大部分基因表達(dá)類(lèi)型的設(shè)計(jì)僅徘徊于某種假設(shè)，和被限定于我們有限知識(shí)的基礎(chǔ)上,。而現(xiàn)在我們可以設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)去系統(tǒng)地探索生物學(xué)廣大的未知領(lǐng)域,。作為研究工具的MICROARRAY的實(shí)用性就在于它的靈活簡(jiǎn)便及價(jià)格低廉。所以在我們研發(fā)這項(xiàng)技術(shù)的種種可能的改變時(shí),，注重它的研究目標(biāo),、簡(jiǎn)便性和低廉性，在我們改進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)時(shí),，應(yīng)本著盡可能降低它在經(jīng)濟(jì),、使用和心理方面障礙的原則，以使一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室在一年內(nèi)就能完成基因組范圍內(nèi)成千上萬(wàn)個(gè)基因研究,。
擁有點(diǎn)樣機(jī),、掃描儀的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室可以在一年內(nèi)進(jìn)行某種條件下成百萬(wàn)個(gè)不同基因的表達(dá)或其特征的檢測(cè)。這一史無(wú)前例的收集大量基因表達(dá)信息的技術(shù)發(fā)展速度驚人,，以至于出版,、分發(fā)、保存的機(jī)制和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的建立速度尚無(wú)法趕上研究所產(chǎn)生結(jié)果的速度,；另外整理,、觀察、解釋大量信息的分析軟件仍處于發(fā)展的初級(jí)階段,。但這不會(huì)成為基因表達(dá)和其他功能研究的阻礙,，這一新的前沿技術(shù)給生物領(lǐng)域的開(kāi)拓者展現(xiàn)出了新的挑戰(zhàn)機(jī)遇。
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