導言

    MICROARRAY,，是固定在固體基片上的大量DAN序列的微陣列,，是許多復雜核酸樣本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具,。日益引起人們興趣的MICROARRAY,，已經(jīng)用于基因作圖,、變異分析和基因表達的檢測，并且,，有希望成為科學研究和臨床應用的標準工具,。
    從原理上和實踐上,，基因芯片都是已用于核酸定性,、定量研究數(shù)十年的雜交方法（Southern blot[12],、Northern blot[13]、克隆雜交和點雜交[14]）的發(fā)展：標記樣本,，再與陣列雜交,；雜交足夠的時間后，適當?shù)叵茨?shù)次,；然后,，探針與固定在特定位置上的樣本DNA互補雜交而顯現(xiàn)雜交印跡。
    用MICROARRAY做平行雜交研究的思想本身并不新鮮,，排列在濾膜上的陣列已經(jīng)被用了很多年[15-17],。然而，不同領域的技術進步已把那些相當笨拙的膜變成了今天更加實用,、有效的平行基因分析的方法：首先,，大規(guī)模的測序工程產(chǎn)生的信息使得DNA集合聚集在一起成為可能，而這些DNA相當于許多組織（從細菌到人）中的全部基因或大部分基因,；其次,，技術進步已經(jīng)使得生產(chǎn)高密度DNA陣列成為可能，從而使成千上萬個基因展現(xiàn)在比標準的載玻片還小的面積上,；最后,，核酸熒光標記和熒光檢測的進步使得這些芯片的應用更加簡便、安全和準確,。
    本綜述旨在描述一種微陣列技術的最新用法,，通常被稱作“點片”或“印片”。之所以這樣稱呼是因為該方法是將通常的大于寡核苷酸（100bp以上）的DNA通過物理分配方法點在固體基片上,，這與最近其它主流的微陣列技術（短的寡核苷酸被直接合成在固體支持物上[18,，19]）方法不同。在標準的點片操作中,，把DNA樣本（PCR產(chǎn)物,、質(zhì)粒等）裝在96或384孔板中，用一個配有一束特殊設計點樣針的機械手伸入板中相鄰的樣本孔中,，吸上大約１µl的DNA樣液,，分別點在處理過的載玻片上。通過交叉的方式,，用適合96孔板的４根一束針頭或384孔板的16根一束針頭成功地將數(shù)千個DNA樣本點在一個玻片面上,。用束狀點樣針接觸每張玻片表面，可同時成功點100-200張具有同樣陣列的芯片,。每點完一次后,，要清洗、干燥點樣針，然后再裝載另幾個DNA樣液,。點完所有的點陣之后要處理玻璃片,，使得DNA固定在玻片表面，以最大限度地減少探針非特異性結(jié)合在芯片上,。MICROARRAY已被用于很多不同的目的,。通過MICROARRAY，數(shù)千個序列能立即被檢測出來,。這篇綜述著重于基因芯片在基因表達研究中的應用以及在基因組表達檢測中的應用原理,，并詳細描述了MICROARRAY的制作和使用過程。

一,、基因表達的檢測

    基因表達檢測的最終技術目標是能確定所關注的任何組織,、細胞的RNA的絕對表達量?？梢韵葟臉颖局谐樘酭NA,，再標記RNA，然后將這些標記物作探針與芯片雜交,，就可得出原始樣本中不同RNA的量,。然而用于雜交的某個特定基因的RNA的量與在一個相應雜交反應中的信號強度之間的關系十分復雜，它取決于多種因素,，包括標記方法,、雜交條件、目的基因的特征和序列,。所以芯片的方法最好用于檢驗兩個或多個樣本中的某種RNA的相對表達量,。樣本之間某個基因表達的差異性（包括表達的時間、空間特性及受干擾時的改變）是基因表達最重要的,，而了解RNA的絕對表達豐度只為進一步的應用或多或少地起一些作用,。
    雙色雜交：為了最大限度地增加差異顯示的可靠性和精確性，我們用兩種具有不同光譜的熒光染料標記兩種不同樣本,，然后混合這兩種探針,，并同時與一張芯片雜交的方法來直接對比這兩種樣本。兩樣本中的一種基因的相對表達量可通過同源目的基因的兩種染料的熒光強度的比值檢測出來,。這個比值對以上討論的那些可能影響與某個特定基因雜交探針絕對量,，但不影響兩種標記探針雜交相對量的因素不敏感。
    DNA基因表達譜芯片的應用范圍：最簡單的基因表達譜檢測是比較兩種不同細胞或組織樣本中的與芯片陣列中相應基因?qū)膍RNA的相對豐度,。例如,，可對比試驗干預前后，或經(jīng)某種處理后連續(xù)時段內(nèi)的細胞以及不同分化時期的細胞,，也可以對比突變型和野生型之間的mRNA表達的不同方式,。這種試驗方法靈活,，使研究者可以收集到有關每種基因表達調(diào)節(jié)的更準確信息。例如,，通過一張芯片上的多核糖體RNA和總mRNA的對比雜交,，可以測出每個基因的翻譯效率；通過細胞核和細胞質(zhì)中的polyA RNA樣本的差異性雜交,，可以估計出細胞核與細胞質(zhì)中的每種polyA RNA的分布：同樣的方法還可以調(diào)查其它類型的亞細胞單位。
    I型和II型試驗：許多受關注的生物學問題都能用雙色雜交試驗這種最簡單的方法來研究,。即兩種樣本直接在一張芯片上進行比較（被稱為I型試驗[20]）,。然而，對于需要對比多個樣本的復雜問題,，這種直接的比較就不適用了,。針對這種情況，我們使用一種替代的試驗設計,，即在每次雜交中加一個一般對照作參考,，這樣既保持了雙色雜交內(nèi)部對照的本質(zhì)特征，又可形成在大量樣本中的推斷對比,，而不需要每個成對樣本單獨對比（這樣的試驗設計為II型試驗）,。這種方法最普遍的應用是用于時段（time-course）試驗[21]，即每個時點（timepoint）與一個原始時點作對比,。由于在某個時點的一個特定基因的量相對于一個固定的參照（原始時點）而被檢測,，那么就可研究通過這個時段的每個基因的活動方式。參照物不一定與被檢驗的樣本有關系,，參照物最主要的屬性是它應提供一個雜交信號,，這樣在芯片上任何一個目的基因的雜交信號比值的分母就不會為零。因為在被對比的大量樣本中,，一個理想的參照物對于每個樣本來說,，都是一樣材料的混合，在這個混合物中,，在一個樣本中表達的任何一個基因,，也會在參照物中表達出來。

二,、儀器設備

    制作和應用基因芯片,，需要兩種設備：一個是制作芯片的機械手（又稱點樣儀）和一個掃描芯片的裝置，一般是一個激光共聚焦顯微鏡（或稱掃描儀）,。許多大的實驗室和生物技術公司對基因芯片技術的沖動已被操作芯片試驗所要求的較高專業(yè)技能和其驚人的價格所沖淡了,。為了使該技術操作更方便，價格更可接受,，我們設計了價格相對便宜,，及對分子生物學家來說更易操作、不需要太多工程專業(yè)經(jīng)驗就能裝配和操作的儀器。并且在網(wǎng)上（http://rana .stanford.edu/hardware）登載了詳細的數(shù)據(jù),、設計結(jié)構和操作說明書,。點樣儀和掃描儀兩項儀器總的價格大約是60000美金。

三,、靶DNA的制備

    靶DNA的選擇：對于大規(guī)?；虮磉_的研究，每個被分析的基因都需要一個特定的雜交目標,，從本質(zhì)上講,，因為任何雙鏈DNA樣本（以及大部分單鏈DNA樣本）都能被點在處理過的玻璃片上，所以點片用的靶DNA的選擇很大程度上取決于所要研究的基因的可獲得程度,。對于那些基因組已被完全測序的有機體,，最簡單的方法是用PCR擴增基因組中已知的、預知的開放閱讀框（或研究者感興趣的子集）,。寡核苷酸合成費用的不斷降低（現(xiàn)在大約每對引物10美元）及96孔PCR儀的廣泛應用使得這一方法十分可行,，甚至對于相對大的基因組也適用。我們實驗室已經(jīng)用這種方法制作了來自于測序酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組[22]大約6200個開放閱讀框的芯片,，其中含啟動子和終止子,。對那些基因組未測序或部分測序的，或者是基因組帶有大量內(nèi)含子的生物體,，這種方法不適合,。對于很多生物體，如人和小鼠,，目前常用來自cDNA文庫的帶有特異性序列的克隆,，以及ESTs來鑒定不同mRNA的轉(zhuǎn)錄物[23]，而與這些轉(zhuǎn)錄物相應的單個cDNA克隆就可以作為靶DNA用于點芯片,。我們實驗室最近已用這種方法制作了約10000個基因的人類基因芯片,，點在芯片上的DNA序列是用PCR擴增的cDNA克隆（I.M.A.G.E. cDNA文庫）[24]的插入片段,。對于那些沒啟動基因組測序計劃的或還沒得到序列的有機體,，來自cDNA文庫的克隆（相當正規(guī)的實驗室能最大限度地減少重復）也能作為點片的靶DNA,。在預先沒有關于序列,、基因圖位點和基因序列數(shù)據(jù)庫編號的任何信息的情況下，也能收集到每個克隆的表達數(shù)據(jù),。
    人們會發(fā)現(xiàn),，用小的DNA片段來代表每個基因要比用全長開放閱讀框或1000bp cDNA更有益。例如,，在相互之間有顯著同源性的酵母基因中,，用代表序列差異最大部分的PCR產(chǎn)物代替整個編碼區(qū),，可增加兩基因之間的鑒別力，每個基因理想的表達量是目前研究的一個復雜問題,。
    PCR擴增：一般來說,，一個100µl的PCR反應所提供的DNA足可以點1000張芯片，我們大多數(shù)的100µl反應體系都是在96孔PCR儀(Perkin Elmer 9600s and9700s)中完成的,。擴增的實驗參數(shù)取決于所用的模板和引物的類型,，然而限定PCR的模板、引物,、dNTP,、鎂離子、標準緩沖液和酶是十分重要的,。一般附加劑如甘油或明膠因改變表面張力或競爭玻片表面的附著位點而影響點片過程,，應避免使用,。
    點樣DNA的制備：為了純化PCR產(chǎn)物以制備點樣DNA,，我們一般用異丙醇沉淀PCR產(chǎn)物，然后在3× SSC中以大約100 ng/µl的濃度重新懸浮DNA,。沉淀既能在PCR孔板中又能在V型底96孔組織培養(yǎng)板中進行,。首先在每孔中加入10µl 醋酸銨（3M，ph5.2）,；再加110µl異丙醇（我們用異丙醇而不用乙醇,，使得沉淀混合物的總體積減少到能與PCR孔板或組織培養(yǎng)板容積相適應）；置孔板于-20℃,，1小時（如果時間不允許,，這一步可省略）；4℃下,，3500×g（或3500rpm）離心沉淀1小時,；在孔板下放2-3層紙巾以防破碎。在一個離心機轉(zhuǎn)頭接頭上可以疊放4塊V底孔板一起旋轉(zhuǎn),，在每塊孔板之間放一個紙墊,，然后把孔板小心地捆在一起，以防滑落,。沉淀后,，吸出或顛倒孔板來棄去液體。用100µl 70%乙醇（用95%乙醇配制,，因為100%乙醇中可能含有熒光雜質(zhì)）洗沉淀,，再離心30分鐘，吸去或輕輕倒出液體,，在體積適合96孔板的抽干機中濃縮干燥沉淀,，（我們用Savant Speed Vac Plus SC210A,；如果沒有該儀器可在空氣中干燥沉淀，但要防止灰塵）,。在10-15µl 3×SSC（ph7.0）中重懸沉淀,，4℃下至少放置12小時，小心封好孔板,，以免蒸發(fā),。因為過多的鹽及DNA的濃縮會影響點片。重新懸浮后,，把溶液轉(zhuǎn)移到軟板中（Fisher3911Micro Test III Fexible Assay Plates） 備用點片,。封嚴孔板，儲存于4℃或-20℃直到使用,。在點片前,，將孔板輕輕地離心一下，以保證所有物質(zhì)都集中于孔底,。
    有些用戶在用這種沉淀程序時,，很難得到前后一致的結(jié)果。有很多從PCR反應中回收純化DNA的附加方法,，也能買到大量純化PCR反應的試劑盒,。我們沒有對點片中的這種方法做過廣泛的調(diào)查。這一步驟主要目的是盡可能減少對DNA終溶液的污染,，鹽,、清潔劑、甘油,、明膠和一些特定的粒子如過柱樹脂等會影響后續(xù)很多點片步驟,。如果操作這一步，必須十分小心,，以確保去除DNA終溶液中的雜質(zhì),。任何其他點片用的DNA溶液制備的替代方法都應先做小規(guī)模的試驗，并且用于整個點片和雜交過程以確保合適,。下面介紹已被成功使用的一種候選方法,。
    聚丙烯酰胺葡聚糖純化法：這種方法的原理是用一個簡單的凝膠過濾樹脂，保留鹽離子和其它一些小的分子,，而排出PCR產(chǎn)物,。因為DNA在水中洗脫而被排出，這樣就不需要沉淀過程了,。同上所述,，操作時必須十分謹慎，以防樹脂污染點片溶液,。要純化100µlPCR反應物,，準備聚丙烯酰胺葡聚糖S400樹脂（Sigma S400 HR）并以2:1的比例用ddH2O稀釋,。以100µl每等份分裝到96孔濾板中（Polytiltronics UN800-PSC/mepp/D）。向板中加400µl ddH2O洗４次,，用真空排槍(Vacuum Manifold)(Polyfiltronics UNIVAES)吸出液體,，把這個濾板套入聚丙烯96孔板中，４℃,，2000rpm （Ｂackman GS-6離心機,，帶有Ｇ.Ｈ.3.8轉(zhuǎn)頭和Ｂackman Microplus carriers）離心５分鐘，棄去所有殘留液體,。加100µl雙蒸水（ddH2O）如上方法離心,。加100µlPCR產(chǎn)物混勻，倒入一個干凈孔板中,，在抽干機中干燥,。最終用３×SSC重新溶解PCR純化產(chǎn)物。

四,、玻片的準備

    我們的微陣列絕大多數(shù)是點在用左旋多聚賴氨酸（poly-L-lysine）修飾處理的載玻片上的,。我們嘗試過許多備選的修飾物，包括多種硅烷,，但沒有一個像poly-L-lysine這樣簡便而可靠,。為了準備左旋多聚賴氨酸修飾的玻片,，把準備的載玻片（Gold Seal 產(chǎn)品,，目錄號是3010）放在金屬或玻璃架上（從Wheaton可以購到各種型號的架子），使玻片垂直固定,，把架子放在一個合適型號的玻璃缸內(nèi),。一定要使用玻片架，架子要放在低速離心機中,，到此步結(jié)束時它們要被旋轉(zhuǎn)干燥,。最好避免把玻片從一種類型的架子上轉(zhuǎn)移到另一種上。雖然大多數(shù)玻片盒上都標有“干凈”,，但處理玻片前再清洗是必要的,。用50g NaOH溶解于200ml ddH2O，再加300ml 95%的乙醇（不要用100％乙醇）制備500ml堿性洗液,，把玻片完全浸沒在洗液中至少２小時,，洗完用ddH2O全面沖洗５次，搖５分鐘沖洗,。保持玻片浸沒在ddH2O中,，一旦洗凈玻片，它們暴露于空氣中的時間越短越好,，因為灰塵會影響修飾和點片的過程,。準備修飾溶液（350ml）,，包含35ml poly-L-lysine（0.1％Ｗ／Ｖ溶于水，Sigma P8920）, 35ml滅菌過濾PBS和280ml ddH2O,，把該溶液倒入一個干凈的玻璃缸中快速把玻片從最后一次洗液中移到修飾溶液中,。輕輕搖動溶液１小時，把修飾處理過的玻片插進一個裝有干凈ddH2O的缸中,，上下抽動５次,，把這個玻片架轉(zhuǎn)移到一個低速離心機中（在架下放紙巾吸液體），旋轉(zhuǎn)使玻片干燥（５分鐘,，室溫下,，1000rpm, Beckman Gs-6離心機，帶有G.H.3.8.轉(zhuǎn)子和Beckman Microplus carriers）,。用鋁箔包裹干燥的玻片,，防止灰塵。把包好的玻片架放進一個真空干燥爐中,，45℃,，10分鐘，真空干燥,。把玻片從鋁箔中取出放進一個干凈的塑料玻片架上（木頭和軟木塞有可能會使玻片上粘上粒子,，最好不用），用封緊的玻片盒室溫貯存,。這些玻片不能馬上用于點片,，必須被固化（或風化）至少數(shù)周，使其表面充分疏水干燥（玻片一般在修飾處理一個月后用于點片）,，修飾處理后的玻片表面的疏水性對于保證DNA樣點足夠小以形成高密度陣列是十分重要的,。一批玻片準備就緒，就要作抽樣質(zhì)檢,，方法是取出一張玻片,，在其表面放150µl H2O, 把玻片與水平呈45度角，觀察水滴在玻片表面滑落,，如果留下明顯的滑落軌跡,，就說明該玻片已經(jīng)可以使用。然而,，檢驗玻片是否能用于點片,唯一最可靠的方法是在這一批玻片中先點幾張作實驗（見點片一節(jié)）,。