來自美國著名的貝爾醫(yī)學(xué)院（Baylor College of Medicine）Verna和Marrs McLean生化與分子生物學(xué)系（Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology ）大分子成像國家中心,，以及德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心（University of Texas Southwestern Medical Center）的研究人員利用低溫電子顯微鏡（Electron cryomicroscopy）技術(shù)首次獲得了結(jié)合在GroES上的分子伴侶GroEL（SR398）單環(huán)突變的構(gòu)造,，從而發(fā)現(xiàn)當(dāng)環(huán)境條件與蛋白天然環(huán)境一致時(shí),，蛋白以及多蛋白質(zhì)聚合物（multiprotein assemblies）會(huì)表現(xiàn)出與靜態(tài)時(shí)不同的作用或動(dòng)力學(xué)——而這正是目前大多科學(xué)家研究蛋白的狀態(tài),，這對(duì)于蛋白研究來說是一個(gè)警告,。這一研究成果公布在最新出版的《Structure》雜志上,。
這一研究報(bào)告第一作者是來自貝爾醫(yī)學(xué)院的陳東華（Dong-Hua Chen,，音譯）,，第二作者為德州大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的宋久利（Jiu-Li Song，音譯）,。
蛋白質(zhì)折疊有兩種形式,，一種是蛋白質(zhì)能自發(fā)的獲得其成熟的構(gòu)型，這種能力被稱為自我裝配（Self-assemby）,；另外一種情況下,，蛋白可能會(huì)采取一種與最終構(gòu)型不同的穩(wěn)定構(gòu)型，這種蛋白不能進(jìn)行自我裝配,，它們形成正確的結(jié)構(gòu)需要分子伴侶（Chaperone）協(xié)助,。
分子伴侶家族龐大，包括Hsp70,、Hsp40和Hsp10等,，其中Hsp60在大腸桿菌中稱為GroEL，Hsp10在大腸桿菌中稱為GroES,，大腸桿菌GroEL是同型寡聚復(fù)合體,，由14個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量58×103亞基組成背靠背的雙環(huán)結(jié)構(gòu)，在新生蛋白質(zhì)的正確折疊和組裝以及在熱或化學(xué)逆境下變性蛋白質(zhì)的恢復(fù)過程中起重要作用,，也幫助折疊錯(cuò)誤的蛋白分子逆轉(zhuǎn)——折疊錯(cuò)誤的蛋白與許多神經(jīng)退化性疾病有關(guān),。
在這篇研究報(bào)告中，chen等人利用低溫電子顯微鏡得到了GroEL蛋白突變體在仿天然環(huán)境下（native-like environment）單個(gè)分子的詳細(xì)二維圖像,，然后利用計(jì)算機(jī)和生物信息學(xué)方法,，他們將這些圖像整合成三維圖像，演示這些蛋白的動(dòng)力學(xué),。
奇怪的是,，當(dāng)研究人員組合GroEL突變體和GroES蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)在得到的三種結(jié)構(gòu)中，有兩種與他們預(yù)期的相同,，但是第三種結(jié)構(gòu)看起來十分奇怪,，就像是一個(gè)鼓起來的氣球,。研究人員表示這是一種從未被觀測(cè)到的一種膨脹,。
因此研究人員認(rèn)為說明在原始天然環(huán)境和研究環(huán)境中,，不同的蛋白質(zhì)可能具有不同的形狀而影響其功能，這也就是說目前的許多蛋白研究可能會(huì)造成一些誤解,，大分子性能表現(xiàn)研究需要在溶液環(huán)境中進(jìn)行,。
附：
如何進(jìn)行蛋白設(shè)計(jì)？
Imagine能根據(jù)需要來構(gòu)建一種全新的蛋白——任何小分子的生物傳感器,，或者一種新型的酶,。這不純粹是幻想，計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Computational structural biology）能幫助我們實(shí)現(xiàn)這一想法,。
世界上的許多研究團(tuán)隊(duì)一樣,，來華盛頓大學(xué)的HHMI研究員David Baker教授也已經(jīng)開始初步設(shè)計(jì)新蛋白和蛋白的折疊，計(jì)算能折疊形成具有自然界中未被發(fā)現(xiàn)的酶活性的氨基酸序列,。這種可行性僅僅受我們想象力的限制：繪制設(shè)計(jì)一種核酸內(nèi)切酶來防止瘧疾,，檢測(cè)生物恐怖試劑的分子傳感器，或者一種阻止HIV進(jìn)化的疫苗,。
科學(xué)家們已經(jīng)多年嘗試開發(fā)一種能根據(jù)氨基酸序列來簡易地預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的方法,。想象只要具備一種生物的基因組的序列，科學(xué)家們就能夠刻畫出這種生物的每一種蛋白的結(jié)構(gòu),，這將使得單從基因序列無法發(fā)現(xiàn)的蛋白的生物分子相互作用,、結(jié)構(gòu)同源性、功能作用和潛在的藥物靶標(biāo)得到揭示,。
雖然還存在漫長的路要走,，但是在算法的改善和計(jì)算能力的增強(qiáng)的情況下，在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)方面的令人興奮進(jìn)展一定到來,。
Structure Prediction
二十世紀(jì)七十年代利用RNAase進(jìn)行的經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)證明了蛋白折疊所需的信息全部存在于自身的氨基酸序列中,。這表明蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)能直接進(jìn)行。但是從序列到結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)就像是生物學(xué)中的“天氣預(yù)報(bào)”,，存在著困難,。因?yàn)楸M管一種相對(duì)小的蛋白也會(huì)存在著多種可能的構(gòu)像。根據(jù)Levinthal's Paradox,，假設(shè)每種氨基酸具有自由的三種軸對(duì)稱轉(zhuǎn)動(dòng)度,，含100個(gè)氨基酸殘基的序列具有3100的可能構(gòu)型。
為了攻克這個(gè)問題,，David Baker等人已經(jīng)開發(fā)了一種叫做ROSETTA的計(jì)算機(jī)程序,，它的核心部分是一種計(jì)算給定蛋白構(gòu)象的能量的方法。消除不可能的蛋白結(jié)構(gòu),，例如暴露于溶劑中的疏水結(jié)構(gòu),，該程序?qū)λ械牡鞍渍郫B的畫面進(jìn)行取樣,，檢測(cè)大約一百萬種具有最低能量結(jié)構(gòu)的可能構(gòu)象。
為了檢驗(yàn)這一研究,，自從1998年開始,，David Baker和他的同事參加了一個(gè)叫做CASP (Critical Assessment of techniques for protein Structure Prediction;http://www.predictioncenter.org/,)的世界性的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)入了ROSETTA預(yù)測(cè)程序的利用階段,。CASP于十多年前創(chuàng)立,，是一種結(jié)構(gòu)生物學(xué)證明平臺(tái)，是一種要求參與者在蛋白結(jié)構(gòu)被闡明擔(dān)未公開的情況下預(yù)測(cè)蛋白的形狀的團(tuán)體性實(shí)驗(yàn)和競爭,。然后這些預(yù)測(cè)與正確的結(jié)構(gòu)相比較,，舉行會(huì)議討論得到的結(jié)果，確定最具前景的預(yù)測(cè)方法和剩下仍未解決的最重大問題,。雖然目前還沒有一種算法能得到完全正確的結(jié)構(gòu),，但是ROSETTA在這些測(cè)試中表現(xiàn)良好，并且每年我們的預(yù)測(cè)與其他小組的預(yù)測(cè)更加接近,。
如何進(jìn)行蛋白設(shè)計(jì),？
我們可以通過在蛋白模型和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)中的技術(shù)進(jìn)步來構(gòu)建具有新型功能的蛋白。
——HHMI,，David Baker
（Reprogrammed：這是通過計(jì)算機(jī)重新設(shè)計(jì)的endonuclease I-MsoI的結(jié)構(gòu),，目的是使其靶向新的DNA位點(diǎn)。這種重新設(shè)計(jì)的酶與野生型相比,，具有靶標(biāo)識(shí)別水平上的位點(diǎn)改變特異性,。這種方法目前已經(jīng)應(yīng)用于更多的靶標(biāo)中去，例如基因疾病熱點(diǎn)（hotspots）,。
Imagine能根據(jù)需要來構(gòu)建一種全新的蛋白——任何小分子的生物傳感器,，或者一種新型的酶。這不純粹是幻想,，計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)（Computational structural biology）能幫助我們實(shí)現(xiàn)這一想法,。
世界上的許多研究團(tuán)隊(duì)一樣，來華盛頓大學(xué)的HHMI研究員David Baker教授也已經(jīng)開始初步設(shè)計(jì)新蛋白和蛋白的折疊,，計(jì)算能折疊形成具有自然界中未被發(fā)現(xiàn)的酶活性的氨基酸序列,。這種可行性僅僅受我們想象力的限制：繪制設(shè)計(jì)一種核酸內(nèi)切酶來防止瘧疾，檢測(cè)生物恐怖試劑的分子傳感器,，或者一種阻止HIV進(jìn)化的疫苗,。
科學(xué)家們已經(jīng)多年嘗試開發(fā)一種能根據(jù)氨基酸序列來簡易地預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)的方法。想象只要具備一種生物的基因組的序列,，科學(xué)家們就能夠刻畫出這種生物的每一種蛋白的結(jié)構(gòu),，這將使得單從基因序列無法發(fā)現(xiàn)的蛋白的生物分子相互作用、結(jié)構(gòu)同源性,、功能作用和潛在的藥物靶標(biāo)得到揭示,。
雖然還存在漫長的路要走,，但是在算法的改善和計(jì)算能力的增強(qiáng)的情況下，在蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)方面的令人興奮進(jìn)展一定到來,。
Structure Prediction
二十世紀(jì)七十年代利用RNAase進(jìn)行的經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)證明了蛋白折疊所需的信息全部存在于自身的氨基酸序列中,。這表明蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)能直接進(jìn)行。但是從序列到結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)就像是生物學(xué)中的“天氣預(yù)報(bào)”,，存在著困難,。因?yàn)楸M管一種相對(duì)小的蛋白也會(huì)存在著多種可能的構(gòu)像。根據(jù)Levinthal's Paradox,，假設(shè)每種氨基酸具有自由的三種軸對(duì)稱轉(zhuǎn)動(dòng)度，含100個(gè)氨基酸殘基的序列具有3100的可能構(gòu)型,。
為了攻克這個(gè)問題,，David Baker等人已經(jīng)開發(fā)了一種叫做ROSETTA的計(jì)算機(jī)程序，它的核心部分是一種計(jì)算給定蛋白構(gòu)象的能量的方法,。消除不可能的蛋白結(jié)構(gòu),，例如暴露于溶劑中的疏水結(jié)構(gòu)，該程序?qū)λ械牡鞍渍郫B的畫面進(jìn)行取樣,，檢測(cè)大約一百萬種具有最低能量結(jié)構(gòu)的可能構(gòu)象,。
為了檢驗(yàn)這一研究，自從1998年開始,，David Baker和他的同事參加了一個(gè)叫做CASP (Critical Assessment of techniques for protein Structure Prediction;http://www.predictioncenter.org/,)的世界性的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn),，進(jìn)入了ROSETTA預(yù)測(cè)程序的利用階段。CASP于十多年前創(chuàng)立,，是一種結(jié)構(gòu)生物學(xué)證明平臺(tái),，是一種要求參與者在蛋白結(jié)構(gòu)被闡明擔(dān)未公開的情況下預(yù)測(cè)蛋白的形狀的團(tuán)體性實(shí)驗(yàn)和競爭。然后這些預(yù)測(cè)與正確的結(jié)構(gòu)相比較,，舉行會(huì)議討論得到的結(jié)果,，確定最具前景的預(yù)測(cè)方法和剩下仍未解決的最重大問題。雖然目前還沒有一種算法能得到完全正確的結(jié)構(gòu),，但是ROSETTA在這些測(cè)試中表現(xiàn)良好,，并且每年我們的預(yù)測(cè)與其他小組的預(yù)測(cè)更加接近。
DE NOVO Desige
蛋白設(shè)計(jì)是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的相對(duì)面,，蛋白設(shè)計(jì)中,，我們尋找能按照一種方式折疊成具有執(zhí)行預(yù)期功能的蛋白結(jié)構(gòu)的序列。該領(lǐng)域已經(jīng)在設(shè)計(jì)具有新功能和結(jié)構(gòu)的蛋白方面取得了進(jìn)展,。1998年,，加州理工大學(xué)的Stephen Mayo和合作者計(jì)算了一種折疊成自然發(fā)生的鋅指結(jié)構(gòu)的序列。2003年,，北加州大學(xué)教授Brian Kuhlman,，利用ROSETTA來設(shè)計(jì)一種十分穩(wěn)定蛋白Top7,，這種蛋白的序列和結(jié)構(gòu)與所有的已知蛋白不相關(guān)。這種93種氨基酸的蛋白被證明是單體并且是折疊的,，x光結(jié)構(gòu)分析表明與預(yù)測(cè)非常吻合,，證明該現(xiàn)代蛋白設(shè)計(jì)方法可以在原子水平上準(zhǔn)確設(shè)計(jì)一種嶄新的蛋白。
構(gòu)建一種全新的蛋白結(jié)構(gòu)傳出令人興奮的消息的同時(shí),，科學(xué)家們也正致力于在蛋白化學(xué)中另外的地方尋找已有的蛋白功能蛋白設(shè)計(jì)領(lǐng)域,。例如Mayo, along with和Bolon利用一種無催化活性的大腸桿菌蛋白-硫氧環(huán)蛋白作為一種新型的能催化組氨酸介導(dǎo)的乙酸對(duì)硝基苯酯水解的酶的骨架。賓西法尼亞大學(xué)的Bill DeGrado的研究小組在四螺旋組蛋白中創(chuàng)建了一種金屬酶位點(diǎn),。與此同時(shí)杜克大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Homme Hellinga和他的同事利用一種大腸桿菌周質(zhì)空間結(jié)合蛋白朝家族的成員作為涉及TNT,、葡萄糖 與其他分子的生物傳感器的骨架。
令人矚目的是,，Hellinga和他的合作者成功的聯(lián)合了他們新工程構(gòu)建的生物傳感器和細(xì)胞信號(hào)通路,，培育了一種能在暴露于TNT時(shí)變成藍(lán)色；這項(xiàng)工作為地雷的探測(cè)帶來新方法,。更近一段時(shí)間以來,，Hellinga小組成功的將一種無催化活性的核糖結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)換成一種異常活躍的丙糖磷酸鹽異構(gòu)酶反應(yīng)中的催化劑,。下一步工作是創(chuàng)造不是由天然發(fā)生蛋白來催化化學(xué)反應(yīng)的酶,。這項(xiàng)工作是十分重要的，并且是一個(gè)艱難的挑戰(zhàn),。
Interaction Disign
除了催化劑的de novo設(shè)計(jì)法,，更新的嘗試是重新工程設(shè)計(jì)大分子之間相互作用的界面，或者在蛋白之間,，或者在一種蛋白和核酸之間,，這是一個(gè)十分重要的目標(biāo)。大分子相互作用在細(xì)胞中起到十分關(guān)鍵的調(diào)節(jié)和功能作用,。重新設(shè)計(jì)大分子的相互作用可以引導(dǎo)新藥物,、研究工具盒診斷方法的開發(fā)。
在David Baker研究小組中,，Lukasz Joachimiak,，其中一個(gè)學(xué)生，與現(xiàn)任加州大學(xué)教授Tanja Kortemme利用一種測(cè)試床（test bed）來檢查colicin E7（一種非特異的DNAase）和它的抑制劑免疫蛋白Im7之間的相互作用,。他們首次證實(shí)只要接觸該復(fù)合體中的任一伴侶就會(huì)導(dǎo)致復(fù)合體不穩(wěn)定,。并且之后證實(shí)了可以通過一種成員的補(bǔ)償效應(yīng)來修復(fù)它們的相互作用。在這種方法中,，他們開發(fā)了一種新的組成伴侶之間具有subnanomolar親和力,，但不能語同類的野生型伴侶相互作用的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)對(duì)。
我們同樣也進(jìn)行設(shè)計(jì)一新的蛋白質(zhì)—DNA之間相互作用的工作。例如,，2002年,，與華盛頓大學(xué)和西雅圖的Fred Hutchinson癌癥研究中心合作，通過融合來自兩種獨(dú)立的管家酶—I-DmoI和I-CreI的區(qū)域,，他們發(fā)現(xiàn)了一種新的核酸內(nèi)切酶E-DreI,。這種新型酶具有父本酶的DNA結(jié)合特異性。
最近,，研究小組中的Jim Havranek擴(kuò)展了ROSETTA設(shè)計(jì)方法來重新設(shè)計(jì)蛋白-DNA之間的相互作用的特異性,。一個(gè)本科生Justin Ashworth計(jì)算設(shè)計(jì)了管家核酸內(nèi)切酶I-MsoI切開一種新的DNA序列的界面。Justin的對(duì)這種重新設(shè)計(jì)的酶的實(shí)驗(yàn)描述表明該沒能有效的切開新位點(diǎn),，但不是原始位點(diǎn),，并且高通量的結(jié)晶體結(jié)構(gòu)分析證實(shí)設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性。
同時(shí)研究小組現(xiàn)在也利用計(jì)算的設(shè)計(jì)方法試圖建立一種有用的治療用途的內(nèi)切酶,。設(shè)計(jì)而成的酶可以轉(zhuǎn)入突變細(xì)胞或者生物體中,，和一個(gè)突變基因的野生型拷貝一起驅(qū)動(dòng)基因治療。通過新型的酶來消除疾病基因之后,，野生型序列可以推進(jìn)DNA修復(fù)，因此修復(fù)了這種遺傳缺陷,。與世界范圍的研究小組合作,，我們?cè)噲D設(shè)計(jì)一種新內(nèi)切酶來失活瘧原蟲生存和傳播所必需的蚊子基因。這種工程設(shè)計(jì)的酶可以在瘧疾的消除計(jì)劃中起到重要作用,。
Other Applications
除了以上提及的方面,，其實(shí)蛋白設(shè)計(jì)方法在許多方面都具有不可預(yù)知的作用。比如許多重要的人類疾病,，包括老年癡呆和帕金森綜合癥,，都與蛋白的錯(cuò)誤折疊形成淀粉纖維有關(guān)。UCLA的David Eisenberg研究小組去年取得了弄清楚這種事件是怎樣發(fā)生的重大突破,，這是他們首次分析淀粉質(zhì)形成多肽的高通量結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)的結(jié)果,。ROSETTA中的設(shè)計(jì)方法被用于證實(shí)產(chǎn)生的淀粉結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)模型與序列一致。
蛋白設(shè)計(jì)同樣具有商業(yè)性的應(yīng)用,。例如Xencor,加州的一家蛋白設(shè)計(jì)公司,，利用它的蛋白設(shè)計(jì)自動(dòng)化技術(shù)開發(fā)了XPro-1595，一種腫瘤壞死因子α的負(fù)抑制劑,，預(yù)期在2006年進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,。Sangamo Biosciences公司的研究者們最近宣布他們成功的利用一種新設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)構(gòu)酶來修復(fù)基因。生物傳感器,，可以用于構(gòu)建芯片,，或者甚至調(diào)節(jié)移植的人工胰腺。
當(dāng)創(chuàng)造全新的蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的情況下，當(dāng)前蛋白設(shè)計(jì)領(lǐng)域的研究的目標(biāo)是將別處發(fā)現(xiàn)的功能賦予現(xiàn)有蛋白的研究中為了增強(qiáng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)相關(guān)聯(lián)的龐大的構(gòu)想和序列空間搜索,，David Baker研究小組中的David Kim開發(fā)了一種分布式計(jì)算版本的ROSETTA,，稱作rosetta@home，可以用于集中世界上成千上萬的電腦的計(jì)算能力,。
最近一次統(tǒng)計(jì),，rosetta@home在全世界內(nèi)具有67,000用戶，可以產(chǎn)生組合的29負(fù)點(diǎn)運(yùn)算的計(jì)算能力—足夠其成為2005年11月公布的世界最頂尖的超級(jí)計(jì)算機(jī)排行榜的第八名,。隨之發(fā)生的網(wǎng)絡(luò)計(jì)算能力在不斷的增加速度,，ROSETTA的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法可以進(jìn)一步改善，同時(shí)也可以更快地檢驗(yàn)新構(gòu)想,。
最近rosetta@home的用戶正在檢測(cè)預(yù)測(cè)CASP7結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn),，將在8月4日結(jié)束。
CASP7完成設(shè)計(jì)后,，David Baker等人將把用戶的計(jì)算能力引導(dǎo)到重要的設(shè)計(jì)問題中,，例如開發(fā)HIV的疫苗。人類難以對(duì)付HIV的主要原因是HIV上的病毒衣殼蛋白（viral coat protein）—gp120,，具有許多高度可變環(huán),。針對(duì)HIV的免疫反應(yīng)傾向于瞄準(zhǔn)這些可變區(qū)域，因此相對(duì)來說不能起到有效的反應(yīng),。然而,，gp120上具有一些關(guān)鍵的區(qū)域是不可變的，因?yàn)樗鼈兪荋IV侵染所必需的,。研究小組中的Bill Schief與NIH(National Institutes of Health)D的Peter Kwong等人的研究小組合作,，設(shè)計(jì)了一系列的新型蛋白疫苗來模仿這些HIV的不可變區(qū)域。
這些例子僅僅是開始,。蛋白設(shè)計(jì)的潛力就好像生物學(xué)自身的多樣性一樣,。具有創(chuàng)造未有的催化劑，改進(jìn)生物分子的相互作用,，和設(shè)計(jì)新的有用蛋白的能力后,，剩下的事就僅受想象力和計(jì)算能力所限制了,。（以上內(nèi)容來自華盛頓大學(xué)HHMI研究員David Baker）（生物通：亞歷）
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