中藥、天然藥物非臨床藥代動力學研究專題討論會會議紀要
http://www.cde.org.cn 發(fā)布時間：2003/11/13 10:40:33 AM
中藥,、天然藥物非臨床藥代動力學研究專題討論會
會議紀要
審評一部 藥理毒理組
會議時間：2003年7月31日
會議地點：中國科技會堂
參加人員：藥代動力學專家,、藥審中心技術人員
新的藥品注冊管理辦法要求中藥、天然藥物注冊分類第一類新藥需進行藥代動力學研究,，但因以往并無比較明確的“技術要求”,，故可能是造成藥代動力學申報資料中存在諸多問題的原因。隨著中藥,、天然藥物有效成分新藥申報品種的逐年增多,，以及審評的需要,，及早提出相關的技術要點和基本要求顯得更加迫切和重要。為了推動中藥藥代動力學的研究,，提高中藥新藥的研究水平,，客觀公正地進行技術審評，藥審中心審評一部組織召開了此次專題討論會,，以期能結合我國中藥,、天然藥物的研究現(xiàn)狀，對非臨床中藥新藥藥代動力學研究的基本要求等提出初步的意見和建議,，也希望能以此與申報者進行交流和探討,，最終達到加快中藥新藥開發(fā)速度、加強和提高中藥新藥研究水平的目的,。
本次專題討論會除討論和制定了中藥,、天然藥物非臨床藥代動力學研究的技術要點和基本要求外（見附件），還重點對以下問題進行了關注,。（1）關于研究的重要性和意義,。分析了目前申報品種出現(xiàn)諸多技術及試驗設計方面問題的原因，認為必須首先明確臨床前藥代動力學研究的目的和意義,。希望通過比較完善深入的基礎研究建立起符合要求的生物樣品分析方法,，并著重關注藥物的體內分布等。非臨床藥代是為臨床藥代服務的,，其最終目的是為臨床有效性和安全性研究服務的,。由于生物樣品分析方法直接在人體建立，既會造成經濟上的浪費,，也不符合倫理學要求,，藥物在體內的分布更不能在人體進行。所以,，在根據中藥有效成分的特點建立起合適的生物樣品分析方法和藥物在動物體內的分布是非臨床藥代動力學研究的最主要目的,。（2）關于質量控制。一般試驗者多忽略或不重視該部分研究內容,，實際上它是方法學評價中的重點內容之一,，該部分不完善或不符合要求也直接影響到樣品測試結果的評價。建議在生物樣品分析方法確證完成之后再開始測試未知樣品,。每個未知樣品一般測定一次,，必要時應復測。生物樣品每天測定時應建立新的標準曲線,，并隨行測定高,、中、低3個濃度的質控樣品,。質控樣品測定結果的偏差一般應<15%,，低濃度點偏差一般應<20%,。若不合格，則當天的測試結果作廢,。（3）關于代謝,。中藥藥代動力學是否需要進行代謝研究一直是有爭議的部分。有專家認為應對代謝（生物轉化）研究提出相應要求,，其限定條件是當原形藥在尿,、糞中排出量低于給藥劑量的50%時（因這時生物轉化可能是體內重要的消除途徑）；或當藥效學試驗缺乏明顯的劑量-效應關系時,，均應進行藥物的代謝研究,，至少應探明代謝的途徑,，以及代謝物與原形藥物的相對量等,。（4）關于多次給藥的研究。在附件中的基本要求中僅提出進行單次給藥的藥代研究,，而未要求多次給藥研究,。但討論認為，當長期毒性試驗結果顯示出藥物有明顯蓄積毒性時,，應考慮進行多次給藥的藥代動力學研究,。（5）關于生物利用度：專家一致認為非注射途徑給藥的新藥應進行生物利用度的研究，因為這是衡量一個新藥質量的重要因素,。但當藥物固有的理化性質難以進行靜脈注射時,，應當對不進行生物利用度測定的原因做出詳細說明。也有專家認為,，對于難溶性藥物,，可考慮使用二甲基亞砜等有機溶劑。（6）關于試驗結果,。因試驗結果直接影響到對受試物在動物體內的動態(tài)變化規(guī)律及藥代特征的評價,，是決定藥代研究是否符合要求的關鍵。為合理,、客觀,、公正地對試驗結果進行評價，建議申報資料應詳細描述所用的分析方法,，引用已有的參考文獻,，并提供每天的標準曲線、質控樣品及未知樣品的結果計算過程,，提供全部未知樣品分析的色譜圖,，包括全部相關的標準曲線和質控樣品的色譜圖等。
本次會議紀要只是介紹一些原則性的基本要求,，藥品審評中心不推薦申請人將本文的要求套用于每個中藥,、天然藥物有效成分的新藥的研究中,，建議在進行具體的研究工作時，應遵循“具體問題具體分析”的原則,。只要所獲得的試驗結果能最大限度地為合理制訂臨床試驗方案提供充分可靠的試驗依據,，采用任何試驗方法都是可以接受的。
附件
中藥,、天然藥物非臨床藥代動力學研究的
技術要點和基本內容
中藥,、天然藥物非臨床藥物代謝動力學研究的目的，在于揭示中藥,、天然藥物新藥的有效成分在動物體內的動態(tài)變化規(guī)律,，闡明其吸收、分布,、代謝和消除的過程和特點,，并根據數學模型提供重要的藥物代謝動力學參數，為臨床試驗設計合理的給藥方案提供試驗依據,。
非臨床藥代動力學的研究,，對于預測受試物可能的不良反應和藥物相互作用具有重要的意義。
鑒于中藥,、天然藥物自身的特點,，其純度可能低于化學合成的藥品，化學結構往往較化學合成藥復雜,，分解產物難以推測,，理化性質（如分子極性、解離度,、脂溶性等）也不十分清楚,。因此在中藥、天然藥物的非臨床藥代動力學研究中應注意這些特點帶來的一些不同于化學藥品非臨床藥代動力學研究的一些特殊性,。
一,、藥代動力學研究的技術要點
1. 受試物
在進行中藥、天然藥物的動物藥代動力學研究以前,，新藥的開發(fā)研制單位應盡可能通過購買,、合成、提取,、純化等方式獲得該藥物主要成分的對照品,。
受試物應為中試放大產品，樣品質量應穩(wěn)定,。
受試物經同位素標記進行藥代動力學研究時,，同位素的種類、標記的位置,、純度等應明確,。
2. 試驗系統(tǒng)
根據藥效學與安全性試驗結果,，選擇適當的實驗動物及體外試驗系統(tǒng)。受試動物必須采用成年,、健康動物,。常用實驗動物為大鼠、小鼠,、兔,、豚鼠、犬,、猴等,。所選動物與性別盡量與藥效學或安全性研究所用動物一致?？诜o藥時,，不宜選用兔和反芻動物如羊等。受試動物在試驗日前三至七日應在試驗場所進行適應性飼養(yǎng),。
3．給藥途徑
給藥途徑原則上應選擇擬臨床用途徑（如有特殊情況,，要加以說明）,，盡量在清醒狀態(tài)下給藥,。
4．給藥量
一般根據藥效學、安全性試驗結果及擬臨床用量來設計給藥劑量,。對于不能達到檢測靈敏度的情況,，可采用能檢測的高劑量進行試驗。
5．給藥周期及給藥頻率
一般采用單次給藥,。
6．生物樣品的定量分析方法
通常選用色譜法,，如HPLC、GC以及LC-MS,、GC-MS,、LC-MS/MS和GC-MS/MS聯(lián)用技術，一般應采用內標法定量,。必要時也可采用生物學方法或生物化學方法,。
在有些中藥、天然藥物新藥的研究中,，有條件制備放射性核素標記的藥物,，采用放射性核素示蹤的方法進行該藥物在動物中的吸收、分布,、代謝和排泄的研究,。在這種情況下，也可以利用現(xiàn)成的放射性核素標記藥物進行動物的藥代動力學研究,。
用放射性核素標記研究藥物時,，需要考慮示蹤原子和標記部位(單標記,，多標記)的選擇、標記物的穩(wěn)定性和標記率等多種因素,。用放射性核素標記藥物,，在用前要進行純度檢查，放化純度要>95%,。定位標記要指明標記位置,。盡量不用以曝射法制備的非定位3H標記物。如用非定位標記,，其測定結果除提供放射活性外,，還應提供色譜分離后能代表原型藥物和活性代謝物的測定結果。
由于生物樣品中總放射性的測定不能區(qū)分原藥及其代謝產物,，因而并不能完全反映藥物的代謝情況,。因此在進行血藥或尿藥濃度的測定時，要注意測定的特異性,，必要時可配合采用薄層層析或采用放射性色譜法,。
生物樣品分析方法的確證應包括以下內容：
（1） 靈敏度：用最低檢測濃度或定量限（Limit of quantitation, LOQ）來表
示。一般以ng/ml(g/L)或g/ml(mg/L)表示,。要求能測出3~5個消除半衰期后血藥濃度或能檢測出Cmax的1/10~1/20的血藥濃度,。
（2）特異性：必須能證明所測的化合物為目標化合物，并能排除不同生物基質（如血,、尿,、糞、膽汁及組織勻漿）的內源性物質和雜質的干擾,。
（3）精密度：用日內及日間變異系數（RSD=（SD/均值）×100%）表示,。要求在標準曲線范圍內選擇低（接近LOQ），中和高（接近上限）三種濃度,，每一濃度重復測定5次,，求出各自的RSD（%）。接近LOQ時RSD<20%,，其余濃度時RSD則應<15%,。
（4）準確度：是指用特定方法測得的生物樣品濃度與真實濃度的接近程度，可用相對回收率表示,，一般應在85~115%范圍內,，在LOQ附近應在80~120%范圍內。應在標準曲線范圍內選擇低,、中,、高三個濃度，每一濃度重復5次。
（5）標準曲線：不同生物樣品（如血,、尿,、糞、膽汁及組織勻漿）應制備各自的標準曲線,，標準曲線應至少由不包括空白的5個濃度組成,，并應覆蓋整個生物樣品的濃度范圍，不得外推求算未知樣品的濃度,。相關系數要求：色譜法應>0.99,，和生物法>0.98。
（6）樣品穩(wěn)定性：對保存在冷凍,，室溫條件下以及凍結一融化過程中的樣品應進行穩(wěn)定性考察,。
（7）方法學質控：應在生物樣品分析方法確證完成之后，開始測試未知樣品,。每個未知樣品一般測定一次,，必要時可進行復測。生物樣品每天測定時應建立新的標準曲線,，并隨行測定高,、中、低3個濃度的質控樣品,，每個濃度雙樣本,。質控樣品測定結果的偏差一般應<15%，低濃度點偏差一般應<20%,。如不合格,，則該天測試結果作廢,。
建議在新藥注冊申請時提供以下研究數據：
（1） 采用色譜分析法,，應提供包括有標準品，空白樣品,，外加樣品及用藥后生物樣品的色譜圖,。采用放射性核素法時，應提供測定特異性的相應證據,。
（2） 標準曲線圖,，其回歸相關分析方程及相關系數。
（3） 日間和日內精密度和回收率數據,，及最低檢測濃度（定量限）,。
（4） 樣品的穩(wěn)定性考核數據。
（5） 未知濃度樣品質控檢查的測定數據,。
放射性核素標記藥物在用前要經過純度檢查,，放化純度要大于95％。放射免疫法和酶標免疫法具有一定特異性,，靈敏度高,，但原藥與其代謝產物或內源性物質常有交叉反應,，需提供證據，說明其特異性,。生物檢定法常能反映藥效學本質,，一般特異性較差，最好用特異性高的方法對比,、證明,，否則要加以說明。
二,、藥代動力學研究的內容
（一）藥物動力學參數測定
1．嚙齒類動物的藥代動力學研究
通常在小動物中進行三個劑量的藥代動力學研究,，一般情況下，可只選擇一種性別的動物,。必要時,，應進行兩種性別的動物進行試驗，并在研究中注意研究性別之間的差異,。
受試動物數：最好從同一動物多次取樣,，盡量避免用多只動物合并樣本。多只動物合并樣品應相應增加動物數,。以藥時曲線的每個時間點應有3~5個數據計算所需動物數目,。
藥物劑量：一般選用低、中,、高三種劑量,。劑量的確定主要根據藥效學的試驗結果。
受試動物在給藥前禁食12小時,。如需收集尿樣,，則在給藥后將動物放入代謝籠。按試驗方案在服藥前,、后不同時間采取血樣和尿樣（尿樣在記錄總體后,，留取所需量），如當日不進行測定分析,，樣品均應儲存在-20℃冰箱中待測,。
采樣點的確定：采樣點的確定對藥代動力學研究結果具有重大的影響。服藥前采血作為空白樣品,，用藥后的一個完整的血藥濃度-時間曲線,，應包括藥物的吸收相、平衡相和消除相,。一般在吸收相和平衡相各應采取2~3個取樣點,，而消除相則應有3~5個取樣點，至少應為3~5個消除半衰期的時間，或采樣持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10~1/20,。如果同時采取尿樣時,，則應采取服藥前尿樣，并參考預試驗的資料,，設計服藥后收集尿樣的時間點,，包括藥物從尿中開始排泄，排泄高峰及排泄基本結束的全過程,。為保證最佳的采樣點,，建議在正式試驗前，選擇2~3個動物進行預試驗工作,，然后根據預試驗的結果,，審核并修正原設計的采樣點。
藥代動力學參數的估算：將試驗中測得的各受試動物的血藥濃度-時間的數據分別進行藥代動力學參數的估算,，求得新藥的主要藥代動力學參數,，其中口服給藥包括：Ka（吸收速率常數）、Tmax（峰時間）,、Cmax（峰濃度）,、AUC（血藥濃度-時間曲線下面積）、Vd（表觀分布容積）,、Kel（消除速率常數）,、t1/2（消除半衰期）、CL（清除率）等,。靜脈注射包括：t1/2(a),、t1/2(b)、K12,、K21,、K10、Vd,、CL(T),、AUC等。一般可用模型法求算,，如無合適模型選擇時，宜按非房室模型分析,。尿藥排泄動力學參數可用總和減量法（虧量法）等方法估算其消除半衰期（t1/2）和排泄速率常數（K）,。如用電子計算機程序處理數據應指明所用程序的名稱和版本。
2．非嚙齒類動物的藥代動力學研究
劑量可選擇擬在臨床上使用的常用劑量的換算劑量,，可以采用一種劑量,，也可以根據將來臨床上使用的要求采用多種劑量。受試動物數量以藥時曲線的每個時間點有不少于3個數據為限進行計算。在研究中應注意研究性別之間的差異,。在試驗設計方面可參考“嚙齒類動物的藥代動力學研究”一節(jié)中對采樣點和藥代動力學參數的估算的要求,。
3．建議在新藥注冊申請時提供以下研究數據：
（1）各個（或各組）受試動物的血藥濃度-時間數據及曲線圖和其平均數據及曲線圖。
（2）提供各個（或各組）受試動物的主要藥代動力學參數和其平均值與標準差,。
（3）對新藥單劑量給藥非臨床藥代動力學的規(guī)律和特點進行簡單扼要的討論和小結,。
（二）生物利用度的研究
生物利用度是判斷藥品所采用制劑及給藥途徑合理性的重要因素，非靜脈給藥應分別采用口服和靜脈給予受試物的方法,，采用適宜的動物進行該制劑生物利用度的研究,。當受試物難以進行靜脈給藥而不能測定生物利用度時，應詳細說明理由,。
（三）藥物的分布
選用大鼠或小鼠做分布試驗較為方便,。選擇一個劑量（一般以治療劑量為宜）給藥后，主要測定藥物在心,、肝,、脾、肺,、腎,、血漿、胃腸道,、生殖腺,、腦、體脂,、骨骼肌等組織的分布,。特別注意藥物在靶器官（包括藥效學與毒理學）的分布。以藥-時曲線作參考,，選2-3個時間點分別代表分布相（或吸收相）,、平衡相和消除相的藥物分布（消除相的組織分布必須包括在內）。每個時間點的組織,，必須有至少5只動物的數據,。
做分布實驗，必須注意取樣的代表性,，如取1/2或1/4個腎臟應注意對稱取樣,。
（四）藥物的代謝
在糞、尿排泄試驗中,，當原型物累計排出量低于給藥劑量50%時,，應進行代謝產物的初步研究，從尿,、糞或其他生物樣品中發(fā)現(xiàn)可能的代謝產物,，以初步簡明其代謝轉化形式,。有可能時，應進行代謝酶的誘導或抑制試驗,。
（五）藥物的排泄
1．尿糞排泄：進行尿和糞的藥物排泄試驗,，要將動物放入代謝籠內，給藥后不同時間間隔分段收集尿或糞全部樣品,。記錄尿體積,，混勻，取一部分樣品,，測定藥物濃度,。糞樣品可先稱重，后研磨均勻制成勻漿,，取出一部分進行藥物含量測定,。取樣直至藥物已排盡（不能檢出）為止。
2．膽汁排泄：一般用大鼠在乙醚麻醉下作膽管插管引流,；待動物清醒后,，以各種途徑給藥，并以合適的時間間隔分段收集膽汁,，進行藥物測定,。
取樣結束后，須計算藥物自糞,、尿,、膽汁排出的速度及總排出量。
（六）藥物與血漿蛋白的結合
研究藥物與血漿蛋白結合的方法很多,，如平衡透析法,、超過濾法、分配平衡法,、凝膠過濾法,、光譜法等，其中以平衡透析法最簡單,、經濟,，但較費時，一般約需24h方達平衡,，最好置冷室進行,，以免藥物或蛋白質破壞。其它方法各有優(yōu)缺點,，根據所研究藥物的理化性質及實驗室條件,，均可選擇使用。
1．如按各種透析法進行實驗,，應按下式計算藥物與血漿蛋白結合的百分數,。
濾出液（游離型）濃度
結合百分數=（1- ）×100
袋內（總）濃度
2．注意事項
（1）藥物與血漿蛋白結合程度受很多因素影響，如血漿pH,、血漿濃度,、藥物濃度等。血漿pH應固定為7.4,，至少選擇三個血藥濃度（包括有效濃度在內）進行實驗,。
（2）必須證明藥物與半透膜本身無結合，應做對照予以校正,。如結合嚴重,，必須改用其它方法。
（3）有時從半透膜上溶解下來的成分會影響藥物測定,，應特別注意,。要分析引起空白讀數高的原因，設法除去,。
（4）可被血漿轉化的藥物,，要加少量酶抑制劑，如氟化鈉等,，以終止其轉化,。
三、小結
試驗前,，研究者應明確其進行藥代動力學的目的,，明確通過藥代動力學試驗需解決的問題。在總結討論的內容中,，應針對試驗目的,，結合試驗內容和試驗結果加以討論，特別應說明其試驗結果是否達到了預期目的,、解決了預期問題,。
2002．8．29
