中藥,、天然藥物注冊分類第一類中藥新藥的藥代動力學評價初探
 
  http://www.cde.org.cn 發(fā)布時間：2003/07/08 11:14:40 AM
 
中藥,、天然藥物注冊分類第一類中藥新藥的藥代動力學評價初探
審評一部 韓 玲 笪紅遠

新的《藥品注冊管理辦法》與原《新藥審批辦法》一樣,，對原一類新藥,，即現中藥,、天然藥注冊分類第一類新藥要求必須進行臨床前藥代動力學研究。這對進行I期臨床人體藥代動力學研究方法學的確立,，對闡明創(chuàng)新中藥新藥治病機理,、評價中藥制劑的內在質量以及指導新劑型的研制等方面均具有重要作用。
隨著新技術,、新工藝越來越多地用于中藥的提純分離,，近幾年申報的創(chuàng)新中藥新藥在逐年增加。通過對近2年申報的第一類中藥新藥的藥代動力學審評,，我們發(fā)現了許多值得討論和分析的共性問題,，為使更多的申報單位在新藥研發(fā)的基礎階段少走彎路,，加快新藥開發(fā)速度，很有必要結合審評中發(fā)現的普遍問題對中藥藥代動力學研究的特點和難點,，以及審評該部分內容的基本要求進行初步的分析和探討。

一,、 問題歸納
（一） 中藥藥代動力學方法學中存在的問題
1．資料不全面：多為方法學介紹不詳細或缺資料,，如HPLC法無色譜圖（包括空白血漿、組織,，以及樣品和標準品色譜圖等）,。有的試驗因選用UV 檢測，一般情況下干擾較多,，尤其是糞便中雜質較多,，不提供色圖譜就無法判斷色譜圖所顯示的分離程度是否良好；有的試驗用GC-MS法,，但不提供質量色譜圖或未進行積分,，或原始資料中顯示出用手動積分等，均不妥,；有的對圖譜中內標峰和待測物峰均不予以標明,。
2．穩(wěn)定性試驗：該項試驗應包括樣品的予處理、冰箱貯存,、反復凍融,、24小時室溫等。但許多資料不提供或未做穩(wěn)定性試驗,，或者資料不全,。
3．回收率試驗與準確性：提供的資料不全，有的僅提供血漿樣品回收率,，而無組織回收率,。有的高、中,、低三個濃度下的回收率結果相差過大,，回收率不穩(wěn)定等。
4．精密度測定：不進行或不提供日內或日間精密度考察資料,。有的試驗中的精密度是基于面積比計算的,，這是不正確的，應按當日的標準曲線求出實測濃度值,，再由此計算出精密度,。
5．靈敏度測定：不進行方法學的探索性研究，尋找增高靈敏度的方法,，是導致靈敏度過低,，無法真正評價新藥藥代的最大問題,。當然，中藥藥代動力學方法學建立的難度也是其根本原因,。
6．標準曲線的制作：該方面的問題包括：（1）許多資料不提供標準曲線,，或僅有血藥濃度標準曲線，而無組織樣品的標準曲線,；（2）試驗過程中不做隨行標準曲線及質控,，有的情況下僅在試驗初期做一條標準曲線，即試驗過程中缺乏質控樣品,；（3）線性范圍選擇不當,，過窄或過寬。過窄時,，導致實測時的高或低濃度超出了標準曲線,，而采用外推法，發(fā)生外延現象,，即此時的標準曲線不能覆蓋整個實測濃度,。過寬時，實測濃度僅僅是線性范圍內的一個尖,，如標準曲線的最高濃度（10000ng/ml）遠遠超出了實測最高濃度（130ng/ml）,；又如線性范圍為100-4000ng/ml，但實測最高濃度僅為170mg/ml,。（4）未給出最低檢出限（LOQ）或LOQ不符合要求,，不能檢測出3-5個消除半衰期或不能檢測出峰濃度Cmax的1/10-1/20的濃度等。另外,，對實測值中小于LOQ的數據均未標出“不能定量檢測”等說明,，因低于LOQ的數據均不可靠。
7．內標選擇：內標選擇不當而起不到內標的作用,。選擇了內源性物質做內標,，因內源性物質的干擾可能使得檢測結果有較大的波動，故可使測定值不準確而影響了評價,。這種情況下,，分析譜圖，可見內標峰的保留時間變化較大,，以及內標的基線在生物樣品中比標準高許多,，因此可提示內標的特異性較低。
（二） 中藥藥代動力學試驗中存在的問題
1．給藥劑量：試驗中劑量選擇不合理是一突出問題,，如僅選擇一個劑量或選擇的劑量遠遠超過藥效學有效劑量范圍,，這樣均導致試驗不符合要求。原則上應在藥效劑量范圍內選擇3個劑量進行試驗。
2．動物：動物的狀態(tài)不符合要求,，如采用麻醉動物進行藥代試驗,；動物數不符合要求，如分布試驗中取血時間點較多,，而每個時間點設計的動物數過少,，僅2-3只動物，在非連續(xù)取樣的試驗中,，動物數應至少5只,；此外，在進行數據統(tǒng)計時,，當數據差異較大時，因無法進行藥代參數的推算或為了降低其變異,，而采用將幾個動物的血樣混合后再測定的方法,，這種做法是錯誤的，因實際的動物數僅為1,，違法了統(tǒng)計學的要求,。另外，多數研究僅利用一種動物,，這也是不符合第一類中藥新藥藥代動力學要求的,。
3．血藥濃度：未提供血藥濃度原始數據或未給出每只動物的血藥濃度值是經常出現的問題。另外,，在測定血藥濃度的試驗中采血時間的選擇不當也是常見問題,，如采血時間太短，未按照t/12的長短進行,，如t1/2為60min,，符合要求的采血時間應為4-5個半衰期長，即240-300min左右,，但實際僅觀察到給藥后18min,，此種情況多是由于方法的靈敏度不夠，無法再對低濃度的血藥濃度進行測定所致,。
4．藥代參數：該部分的主要問題包括：（1）未能全面提供藥代參數,，如AUC，T1/2,，CL,，生物利用度，Vd等,；（2）線性動力學確定的依據不足,，試驗結果顯示有的參數（t1/2）符合線性動力學，有的符合（如AUC, Vd等與劑量有明顯關系）非線性動力學，但卻不對各矛盾的結果進行分析和解釋,；（3）對參數與文獻報道的結果出現很大差異的情況不進行分析或查找原因,；（4）三個劑量的參數之間相差較大，如高,、中劑量的AUC幾乎重疊或增大劑量AUC反而明顯降低等,；不同給藥途徑的t1/2相差較大，如肌肉注射和靜脈注射的t1/2分別為1.06和0.39小時,；不同動物間的差數相差較大,，如犬的大鼠的T1/2分別為0.5小時和8-9小時等。當參數出現明顯異常時,，僅羅列結果,，而不對結果進行說明、分析和判斷,。
5．分布試驗：該部分的問題較多,。（1）分布試驗中考察的指標不全面，如藥效學試驗與藥代動力學研究相分離,，不能根據藥效靶效應器官進行相關組織分布的測定,，如治療骨質疏松藥物的藥效靶器官和抗腫瘤藥物的毒性靶器官均為骨組織，但卻忽視了對骨組織的分布測定等,。（應根據藥物作用的靶效應器官和靶毒性器官進行組織分布的檢測,，這對揭示藥物作用具有重要作用）（2）對口服給藥途徑的藥物，當發(fā)現胃壁和腸壁中分布較高,，且糞便排泄率也較高時,，應進一步搞清是未吸收造成的直接排泄，還是從腸道排泄,，不應僅根據糞排率推算生物利用度,。（3）血中濃度測不出，但卻有組織分布時,，應進一步搞清原因,。（與其他藥物有相似的代謝特性，則應提供相關的文獻資料）,。（4）當組織分布的結果與靶效應器官不相符或與藥物起效及作用持續(xù)的時間不相符時,，不做任何解釋和分析。如用于心源性休克和冠心病的藥物,，藥效和機制研究的靶器官均為心臟,，但藥代組織分布測定表明心臟中無任何分布；或給藥后短時間內即已測不出組織分布,，但藥效作用還存在,，應進一步分析、解釋是因檢測靈敏度不夠，還是因藥物可能在機體內發(fā)生了代謝,，代謝物是否為發(fā)揮藥效的物質基礎（即應明確是方法學問題,，還是物質基礎未搞清）。（5）在進行組織分布測定時未同時測定血藥濃度,，或血藥濃度結果與血藥濃度試驗中的結果發(fā)生矛盾,，例如某藥物給藥后某一時間點的血濃為78ng/ml，而相同給藥劑量,、相同給藥后時間點的血藥濃度試驗中卻顯示為206ng/ml,，相差近3倍，這種情況一般為方法學有問題,。（6）分布試驗中選擇的劑量不符合要求,，有的大大超過藥效學有效劑量。（7）分布試驗中檢測總時間選擇不當,，如有的藥物僅測定了給藥后40min的組織分布,，但其他試驗如荷瘤動物分布試驗卻顯示出60min分布達高峰，480min時瘤組織中仍有分布的結果,，顯然選擇40min的觀測時間明顯不夠。另外,，檢測的各試驗點選擇不當,，如僅選擇給藥后2個時間點進行分布試驗，并不能充分反映出藥物在體內的動態(tài)分布情況和維持時間,。（8）當分布試驗的結果顯示某一組織內分布異常高時,，未結合毒理學研究分析其可能的毒性靶器官。（9）對不同方法測定的組織分布相矛盾的結果不能充分解釋和分析,，如小鼠3H-標記法和大動物GC-MS法測定的結果顯示,，小鼠腦和脂肪組織內有藥物分布，但大動物這兩個組織中卻無分布,，對此不能作出合理解釋,，也就不能相應地對長毒試驗中出現的神經系統(tǒng)的毒性作出解釋。
6．排泄試驗：取樣時間點選擇不當,，如尿液收集時無上升支取樣點,，一下就進入了平臺期，必然影響了排泄的時間和量的判斷,。藥物排泄的途徑觀察的不全面,，如當血藥濃度測定發(fā)現有雙峰現象時，未做膽汁排泄試驗,，因此就不能全面,、合理地反映出藥物的排泄途徑。另外，排泄試驗的數據提供的不全面,，如僅提供某個時間點的累積排泄率,，而不提高每只動物不同排泄途徑的實測數據。
7．代謝或生物轉化：藥物在體內代謝轉化的研究是闡明藥物進入體內變化,，揭示藥物及其代謝物在體內消長,，以及藥理作用和毒性的重要環(huán)節(jié)。該部分研究也是中藥藥代動力學研究的難點,。幾乎全部藥代資料均不能提供該部分的試驗結果,，多數對可能出現代謝物的情況僅通過推測而得出初步結論。如,，當色譜圖顯示出有未知峰時,，提示體內可能發(fā)生了代謝或轉化，在此情況下不進行進一步的研究,，僅根據保留時間等間接推測可能的代謝物,；當測不出血藥濃度時，也未經過代謝研究就盲目地推測藥物大部分被代謝,，這樣推測的依據顯然是不充分的,。如一般認為甙（苷）口服后在腸道中經腸道菌群水解成甙元（苷元）后才可在小腸下部吸收，而顯示藥效,，但有的試驗卻不能測出體內存在其代謝產物甙元,，因此對發(fā)揮藥效的物質基礎就無從判斷。
8．血漿蛋白結合率：許多申報資料忽視了該項測定,，而不提供血漿蛋白結合率的資料,。有的試驗不規(guī)范，如選用大鼠血清而不是小牛血清測定,，而補充資料中顯示兩種血清測定的血漿蛋白結合率結果相差很到,，如大鼠血清測定值為15%，而小牛血清卻為46%,。因此,，正確的試驗方法對評價各項指標起到至關重要的作用。
9．生物利用度：口服給藥的品種生物利用度的問題很突出,。多數情況均求不出生物利用度或得到不正確的生物利用度的結果,。有的因藥物的水溶性較低，而強調不能靜脈給藥,，故不提供絕對生物利用度結果,，但也不進行相對生物利用度的測定。有的求出的生物利用度明顯錯誤,，分析原因,，可能主要是因為方法學的靈敏度較低,，故導致在口服藥效學有效劑量下測不出血藥濃度，而盲目通過增大劑量的方法進行試驗,，這樣勢必造成口服給藥量遠遠超過靜脈注射劑量,，如有的藥物口服劑量是靜脈注射劑量的400倍才能測出血藥濃度，因此計算出的生物利用度非常低,，僅0.15%左右,，這種情況下計算出的生物利用度根本不能如實地反映出藥物真正吸收利用的情況。

二,、幾點思考
通過上述對中藥藥代動力學資料中存在問題的分析和歸納,，得出以下幾點思考：

（一）第一類中藥新藥進行藥動學研究的必要性

通過藥代動力學研究可確定藥物在體內的代謝過程和特點，對該藥物是否具備成為新藥的條件作出初步判斷的基礎,。通過對藥物及其代謝產物體內經時變化的研究,，可有利于對其藥效強度和毒性作用的時程變化作出相關分析，藥代動力學參數也可為毒性試驗設計和毒理效應分析提供依據,。通過對不同種屬動物的藥代動力學研究,，可闡明藥物體內處理的種屬差異，為分析藥效學的種屬差異提供基礎,。通過對體液和不同組織器官藥物濃度的測定,，可進行藥物體內分布與作用靶器官的相關性分析。只有認清了藥物在體內吸收,、分布,、代謝和排泄的基本規(guī)律以及生物利用度，才能為臨床制定安全,、有效,、合理的用藥方案提供基礎支持,。
WHO曾強調“對評價藥物療效與毒性來說,，藥物動力學的研究，不僅在臨床前研究階段,，而且在新藥的所有階段都很重要”,。中藥藥動學的研究同樣對新藥的研發(fā)，對提高中藥新藥的研制水平,，對促進中藥現代化和中藥走向世界都具有極為重要的意義,。但由于中藥藥代動力學研究難度較大，任務艱巨,，需要在借鑒化學藥物藥代動力學研究方法,、吸收現代科學知識的同時，在中醫(yī)藥理論的指導下,，不斷創(chuàng)新,、完善,、構建適合于中藥藥動學研究的新理論、新技術和新方法,，在逐漸的探索過程中不斷地提高,。無庸質疑，也正是由于中藥藥代動力學的難度和困難,，更說明進行藥代動力學研究的必要性,。

（二）進行藥代動力學特征參數測定的意義

可根據吸收速率常數、消除速率常數,、半衰期,、表觀分布容積、生物利用度等,，作為中藥劑型選擇和給藥途徑選擇的依據,。如對半衰期較短、給藥頻繁的藥物可制成緩釋制劑,，對治療指數窄的藥物可制成控釋制劑,，對在胃腸道不穩(wěn)定或肝臟首過效應大的藥物可制成注射劑或其他非口服制劑等；如多肽,、酶類藥物口服制劑的生物利用度很低,，一般采用注射給藥途徑。通過對藥動學參數的研究,，還可優(yōu)化制備工藝和工藝參數,，也可用來評價制劑工藝的優(yōu)劣等。通過藥動學研究得出的藥物在體內的吸收,、分布,、代謝、排泄等方面的重要資料,，可以為今后藥物的結構改造提供理論依據和研究方向,，以定向尋找、研制出更多的低毒,、長效,、高效、穩(wěn)定,、劑量小,、副作用低的新藥。藥代動力學的研究結果可用于闡明中醫(yī)藥防病治病的機制,，以及科學合理地制定臨床給藥方案,，即妥善設計給藥方法，解決合理用藥問題（如計算首次劑量,、維持劑量,、給藥間隔時間,、給藥途徑等），以使藥物選擇性地到達靶器官,，并在一定時間內維持有效濃度的水平,，從而提高藥效，減少不良反應等,。
（三） 藥代動力學研究方法的選擇
方法學的選擇和建立直接影響到藥代動力學研究的結果和評價,。隨著現代科技的發(fā)展和配套儀器分析技術的成熟，特別是高效液相色譜儀,、氣相色譜儀,、氣質聯用色譜儀、液質聯用色譜儀,、放射性同位素分析等技術應用的日益廣泛,，已為中藥藥代動力學研究提供了相當的技術支持和保證。
在進行一類中藥新藥藥代動力學研究時應具體采用什么樣的分析方法,，需要針對藥物的特性,，如應明確待測藥物屬于生物堿類、苷類,、有機酸類,、內酯類，還是其他類型,；待測藥物的理化性質如何,，包括化學結構、分子式,、分子量,、熔點、溶解度,、脂溶性等,，這對估計在體內的可能代謝產物，確定提取藥物的溶劑系統(tǒng)及予處理方法都有較大的作用,；此外,，也應了解相關的藥效學資料,，如動物的有效劑量及臨床人擬用量等,，這對估計可能的血藥濃度范圍，考慮測定方法的靈敏度等也都起到相當的作用,。當然,，在研究或立題的基礎階段就應著重方法學的探索，就應盡量采用較高靈敏度,、準確度和專一性的方法,，以滿足對低濃度藥物的測定,。以下是目前中藥藥代動力學研究中常見的兩種分析方法。
（1） 高效液相色譜法：目前,，多數申報藥代資料基本采用HPLC法,。此
方法是70年代發(fā)展起來的，特別適合高沸點,、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析,，目前仍是藥物分析中最常用的手段。近年來其檢測部分有了較大的發(fā)展,。其中紫外檢測法是最常用的檢測方法,；對小劑量低血濃度的藥物，則可考慮采用熒光或電化學檢測的方法,。另外,，利用蒸發(fā)光散射檢測器對無紫外吸收的化合物，如甾體化合物,、人參皂苷等均具有較好的檢出靈敏度,。中藥中有些紫外吸收弱，或無特征紫外吸收的成分,，直接用HPLC測定,，其靈敏度和分離度均不佳，此時可利用柱前,、柱后衍生化的方法,，使這些成分較精確地測定出來。
（2）氣相色譜法：該方法對脂溶性強,、易氣化的藥物的檢測為常用手段,。氣相色譜-質譜聯用技術已成熟，該方法綜合了氣相色譜和質譜的優(yōu)點（氣相色譜的高柱效,、高分離性能與質譜的定性功能）,，彌補了各自的缺陷，因而具有靈敏度高,、分析速度快,、分辨率高、鑒別能力強的特點,，是目前能夠達到pg檢測水平的方法?，F已有部分申報資料開始應用氣相色譜-質譜聯用的方法，進行藥代動力學研究,。 盡管申報資料方法學部分還存在許多的問題和不足,，但將GC-MS聯用技術應用于中藥藥代動力學研究，已是中藥分析手段現代化的重要體現和嘗試,。我們堅信,，隨著分析儀器的不斷完善與發(fā)展,，檢測技術的成熟與推廣，應用范圍的擴大,，中藥藥代動力學的方法學研究會日臻完善和提高,。
（四） 中藥藥代動力學研究中應注意的問題
1． 分析方法建立時應注意的問題
方法學考核的內容應完善，包括靈敏度（檢測限）,，精密度（日內變異系數）和重復性（日間變異系數）,，回收率（準確度），線性（標準曲線）,，特異性（專屬性,，選擇性）等方面。應清楚說明分析方法的靈敏度,、特異性,、精密度、回收率和線性范圍,。其中,，特異性是方法建立的關鍵，只有特異性達到要求后,，測得的結果才有意義,，要做到這點，必須對生物樣品進行有效的分離與選用有足夠專一性的檢測器,。要重視穩(wěn)定性試驗,，保證樣品處理開始到分析完成的整個過程中樣品的予處理、貯藏,、凍融,、放置等環(huán)節(jié)的穩(wěn)定，這對定量結果的可靠性分析是不可缺少的必要條件,。標準曲線制作時,，生物樣品分析中的標準曲線應該是空白生物樣品中加入藥物后配制成一定濃度，經予處理后測定生物樣品的標準曲線,，用直接加入流動相內配制的溶液做樣品分析的標準曲線的方法是錯誤的,。對分析樣品而言，工作曲線的精密度和準確度以及RSD應不超過10%,。線性范圍選擇時,，應至少選擇5個濃度點，要符合藥物有效濃度的范圍,，即標準曲線應覆蓋整個待測樣品的濃度范圍,。最低檢測限（LOQ）要至少能檢出3-5個消除半衰期后的血藥濃度或能檢出鋒濃度（Cmax）的1/10-1/20的血藥濃度,。其LOQ檢出濃度的信號應達到噪音的10倍,，藥時曲線消除相的低濃度必須有一定的準確度,，對測定的藥物濃度在線性范圍之外時不能通過外推法求得。在分析樣品的過程中,，每次應用2-3個隨行標準做為質控樣品,，只有當質控樣品代入標準曲線計算的濃度與其靶值比較，其準確度,、精密度均符合一定要求時,，才可沿用原標準曲線，否則需重新制作新的標準曲線,。
2． 研究內容方面應注意的問題
中藥藥代動力學方面目前尚無統(tǒng)一的標準,，仍按化學藥的要求進行。研究的內容應包括藥物的吸收,、分布,、代謝、排泄及蛋白結合率等,。若為口服制劑,，還應測定絕對生物利用度；若藥物在體內被明顯代謝,，則要求盡量確定藥物在動物體內的代謝部位,、代謝產物、代謝途徑,、代謝物活性或毒性等,。另外，提供資料時應全面,，應盡量提供原始數據和原始圖譜等,。
具體應注意以下問題：（1）樣品：必須為原料藥（有效成分）或臨床制劑，不得使用標準品,。（2）體內藥物濃度檢測方法：應符合生物樣品測定要求,，應選用適宜的、靈敏度較高的檢測方法,。（3）動物選擇：盡量選擇與藥效試驗相同的動物,，必須進行兩種動物的藥代研究，包括嚙齒類和非嚙齒類動物,。（4）劑量及給藥途徑的選擇：應采用擬推薦的臨床給藥途徑,，在藥效學有效劑量和長毒劑量區(qū)域內選則三個劑量做藥時曲線。不能靠隨意增大劑量來滿足方法靈敏度的不足,。（5）藥代動力學參數：應提供全面的藥代動力學參數,， Cmax，Tmax, T1/2醹，T1/2鈣,，Vd,，Cl等?？诜o藥應提供生物利用度數據,，如無法提供應充分說明理由。（6）應測定血漿蛋白結合率,。（7）分布試驗：至少應包括心,、肝、脾,、肺,、腎、腦,、胃腸道,、生殖腺、脂肪組織,、骨骼肌等,。還應結合藥效學作用的靶器官或毒性靶器官觀察相應的組織分布。（8）排泄試驗：應至少進行尿,、糞,、膽汁中的排泄量測定。（9）代謝研究：當原型藥物的藥動學過程不能解釋藥效時,，應研究活性代謝物,，對可能的原因做出分析。

三,、結語
中藥現代化自1997年啟動以來,，已取得了長足的進步。我們深知,，每一個戰(zhàn)略目標的實現都需要有深厚的基礎研究作為理論依據和技術支撐,。隨著我國創(chuàng)新中藥研究的加速發(fā)展，隨著一類中藥新藥申報品種的增多,，已暴露出中藥藥代動力學基礎研究環(huán)節(jié)的薄弱,。但因為目前中藥藥代動力學研究仍處于剛剛起步階段和開創(chuàng)性研究階段，出現一些問題是難免的,。關鍵是研制單位必須重視和加強基礎研究,，不斷探索，不斷完善中藥藥代動力學研究的技術和方法,，增強創(chuàng)新能力,。只有這樣,，才能使中藥藥代動力學的發(fā)展不斷走向新的高度。
中藥藥代動力學研究的現狀對我們的審評工作也提出了相應的較高的要求,。一方面,，中藥藥代動力學基礎研究的薄弱和剛剛起步，使我們的技術審評無前車之鑒,；另一方面,，又要求我們必須充分認識到中藥藥代動力學研究的現狀,，結合其發(fā)展的實際,，即要在技術上嚴格要求，又不能過分苛求,，不延緩或阻礙中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)的進程,。我們將在監(jiān)、幫,、促方針的指導下,，積極鼓勵研發(fā)者在中醫(yī)藥理論指導下不斷完善，構建適合于中藥藥代動力學研究的理論和技術體系,。