新型冠狀病毒核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒說明書內(nèi)容介紹
生物制品及體外診斷試劑組 張麗
目前已確認(rèn)急性傳染性非典型性肺炎（SARS）的致病原為新型冠狀病毒,，對(duì)新型冠狀病毒感染的檢測(cè)主要集中在以下兩個(gè)方面：（1）分子生物學(xué)檢測(cè)。（2）抗體檢測(cè),。2003年3月27日香港科學(xué)家設(shè)計(jì)出第1個(gè)可以用于新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的PCR試劑盒,，2003年4月3日WHO公布了7對(duì)引物用于新型冠狀病毒的RT-PCR檢測(cè),，歐盟于2003/8/22批準(zhǔn)德國(guó)HAMBURG. Abbott Laboratories and GmbH合作的產(chǎn)品RealArtTM HPA Coronavirus LC RT Reagengs進(jìn)入市場(chǎng)使用（CE marked）,。目前我國(guó)已有抗體測(cè)定,、病毒核酸測(cè)定試劑盒批準(zhǔn)試生產(chǎn)。與以往診斷試劑的說明書相比,，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒的說明書中增加了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋,、檢測(cè)方法的局限性，并附該產(chǎn)品的臨床考核結(jié)果,，其目的是避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的誤解,。本文對(duì)已批準(zhǔn)試生產(chǎn)的新型冠狀病毒核酸測(cè)定試劑盒說明書中較重要內(nèi)容及撰寫目的作一詳細(xì)介紹，并附該部分內(nèi)容的樣稿（附件）,，以便于關(guān)注者獲取更多的信息,，并幫助使用者和臨床醫(yī)生準(zhǔn)確的理解其實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
一.關(guān)于方法 原理
已批準(zhǔn)試生產(chǎn)的產(chǎn)品及RealArt TM HPA Coronavirus LC RT Reagengs均采用核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)的方法：首先從樣本中提取病毒RNA,，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,，在核酸擴(kuò)增開始時(shí)加入熒光標(biāo)記探針，探針的5,，端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)（FAM）,，3，端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)（TAMRA）,，當(dāng)探針完整時(shí),，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)非常接近，報(bào)告基團(tuán)熒光被淬滅基團(tuán)抑制,。在PCR過程中,，如果靶序列存在,，熒光標(biāo)記探針可特異性地結(jié)合到靶序列上。在PCR擴(kuò)增過程中,，由于Taq DNA聚合酶的5,，端核酸外切酶活性，使已經(jīng)退火并結(jié)合到模板上的熒光雙標(biāo)記探針被酶解,，解除TAMRA對(duì)FAM的淬滅,。從而使報(bào)告基團(tuán)表現(xiàn)熒光的活性,，在480nm的激發(fā)光下產(chǎn)生520 nm的熒光。PCR擴(kuò)增后,，進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定,。
雖然上述產(chǎn)品均采用了核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)的方法，但不同企業(yè)產(chǎn)品之間仍存在許多不同之處,，如擴(kuò)增片段所處基因組的具體位置不同，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同,。每個(gè)產(chǎn)品能夠測(cè)定的樣本類型不同如血液樣本、漱口液樣本,、糞便樣本,。針對(duì)不同類型的樣本,，病毒核酸的提取方法不同,。不同產(chǎn)品分別采用了逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行的一步法或逆轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增分開進(jìn)行的兩步法。
二.關(guān)于臨床使用目的
鑒于目前有關(guān)新型冠狀病毒的基礎(chǔ)研究仍比較薄弱,，該檢測(cè)方法存在許多局限性,，我們參考WHO,、美國(guó)CDC、我國(guó)CDC等有關(guān)文獻(xiàn),，將新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的臨床使用目的定位于：可試用于新型病毒感染的輔助診斷,，檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù),。
三.關(guān)于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的解釋
為避免對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的誤解,，參考了WHO,、美國(guó)CDC,、我國(guó)CDC等有關(guān)文獻(xiàn)，以及上述產(chǎn)品完成的臨床考核結(jié)論,，在說明書中詳述了對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的解釋,，其目的是再次強(qiáng)調(diào)一個(gè)測(cè)定結(jié)果不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)，最終診斷必須密切結(jié)合臨床指征及其它實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果綜合考慮,。
四.檢測(cè)方法的局限性
1.檢測(cè)方法設(shè)計(jì)的局限性
該類試劑的特異性主要由引物和探針決定,，還與選擇嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件有關(guān)。通過與其它已知冠狀病毒的序列進(jìn)行同源性比較 ,，選擇引物和探針,。已批準(zhǔn)產(chǎn)品擴(kuò)增引物和探針都是依據(jù)新型冠狀病毒pol區(qū)加以選擇,、設(shè)計(jì)的,，研發(fā)人員在設(shè)計(jì)過程中參考了WHO網(wǎng)站公布的信息。WHO網(wǎng)站公布7對(duì)引物的同時(shí)說明：采用該7對(duì)引物進(jìn)行病毒核酸測(cè)定的敏感度和特異性尚有待進(jìn)一步研究,、確證,。由于對(duì)新型冠狀病毒認(rèn)識(shí)有限，并且因疫情的特殊性，產(chǎn)品研發(fā)在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)完成,，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行的優(yōu)化工作有限,，所以在方法設(shè)計(jì)方面有不可避免的局限性。
2.臨床考核的局限性
研究,、評(píng)價(jià)診斷試劑的臨床診斷價(jià)值,，最基本的方法是確定“金標(biāo)準(zhǔn)”,，選擇研究對(duì)象,、進(jìn)行盲法比較,。對(duì)于SARS而言,，從患者體內(nèi)或標(biāo)本中分離到SARS-CoV是唯一可以令人信服的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于試驗(yàn)條件等的限制,，對(duì)患者標(biāo)本進(jìn)行病毒的分離和培養(yǎng)是不可能的,。又由于臨床樣本資源的問題，臨床研究受到很多方面的限制,。研發(fā)單位按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求》（SFDA網(wǎng)站發(fā)布）完成了臨床考核,。鑒于SARS的特殊性，臨床考核試驗(yàn)尚不完善,，所以臨床考核結(jié)論有其局限性,。
綜合目前對(duì)病原體的認(rèn)識(shí)、檢測(cè)方法的設(shè)計(jì)和臨床考核的局限性,，在說明書中增加了檢測(cè)方法局限性項(xiàng)目,，其目的是幫助使用者和臨床醫(yī)生準(zhǔn)確的理解該檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
五.臨床考核結(jié)果
產(chǎn)品說明書中羅列了研發(fā)單位的臨床考核情況,，包括臨床考核單位和詳細(xì)的考核結(jié)果,，其目的是便于使用者獲取更多的信息。需要說明的是,，研發(fā)單位按《SARS診斷試劑生產(chǎn)研制技術(shù)要求》完成了臨床考核,，其樣本數(shù)特別是各不同時(shí)間段的樣本數(shù)有限。另外考核結(jié)論是以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn),，但臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中有很多不確定和可變的因素,，而且還存在誤診和臨床資料不完整等實(shí)際情況。
已完成的臨床考核結(jié)果顯示：在發(fā)病初期如10天內(nèi),，對(duì)臨床確診SARS患者血清樣本和糞便樣本的陽(yáng)性檢出率約為50-60%,，對(duì)漱口液樣本的陽(yáng)性檢出率約為70%左右。在發(fā)病晚期如20-30天,，對(duì)臨床確診SARS患者血清樣本和漱口液樣本的陽(yáng)性檢出率明顯下降,，約為30%左右，糞便樣本的陽(yáng)性檢出率約在60%左右,。
對(duì)臨床確診SARS患者連續(xù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示：只有在病程的某一時(shí)期,，核酸的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而在發(fā)病初期和晚期,，核酸的檢測(cè)結(jié)果都可能為陰性,。
六、使用過程中的注意事項(xiàng)：
1,、考慮到SARS為急性傳染病,，為保證產(chǎn)品在使用過程中對(duì)使用者和環(huán)境的安全。注意事項(xiàng)中建議嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范、《傳染性非典型肺炎病毒研究實(shí)驗(yàn)室暫行管理辦法》,、《非典型肺炎病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)本采集技術(shù)指南（試行）》,。
2、由于樣本的采集方法對(duì)采樣人員有一定的危險(xiǎn)性,，注意事項(xiàng)中提醒采樣人員應(yīng)高度重視安全防護(hù),。
3、由于PCR試劑盒操作相對(duì)復(fù)雜,，注意事項(xiàng)中建議技術(shù)人員必須經(jīng)過嚴(yán)格的安全和技術(shù)培訓(xùn),。
附件：《新型冠狀病毒核酸擴(kuò)增（PCR）熒光檢測(cè)試劑盒說明書》相關(guān)內(nèi)容
【使用目的】
用于 ***** 標(biāo)本中新型冠狀病毒核酸RNA的定性檢測(cè)，可試用于新型冠狀病毒感染的輔助診斷,。本品檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考,，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋,，詳見【實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋】及【本檢測(cè)方法的局限性】,。
【實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋】
1. 至少符合下列情況之一才能報(bào)告該病例新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性
1.1 至少2個(gè)不同類型的臨床標(biāo)本（例如血漿樣本、糞便樣本等）檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,；
1.2 從發(fā)病第2天起不同時(shí)間收集的相同類型的臨床樣本連續(xù)2次以上檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,；
1.3 使用2種不同的檢測(cè)方法或試劑（基于其他反應(yīng)原理或其他企業(yè)產(chǎn)品）對(duì)同一臨床樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性。
對(duì)于檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的報(bào)告,，只表明該樣本中有新型冠狀病毒的遺傳物質(zhì)RNA存在,，并不表明有活病毒存在，或病毒量足以感染其他人,。
2. 現(xiàn)有的PCR檢測(cè)方法雖然特異性較高,，但靈敏度仍有欠缺，因此測(cè)定結(jié)果為陰性并不能排除樣本中含有病毒,。
3. 根據(jù)臨床考核結(jié)果,，本品的測(cè)定結(jié)果會(huì)因采樣時(shí)間的不同而異，因此要將測(cè)定結(jié)果密切結(jié)合臨床指征和其他測(cè)定結(jié)果進(jìn)行綜合分析（詳見【臨床考核情況】）,。
【本檢測(cè)方法的局限性】
1． 本品擴(kuò)增引物和熒光探針是根據(jù)新型冠狀病毒 pol 區(qū)加以選擇,、設(shè)計(jì)的，其靈敏度和特異性尚有待進(jìn)一步研究,、確證,。
2． 本檢測(cè)系統(tǒng)的交叉反應(yīng)性還沒有完全確定，特別是對(duì)冠狀病毒的種屬交叉反應(yīng)性未進(jìn)行臨床考核,，陽(yáng)性結(jié)果不能排除擴(kuò)增的是冠狀病毒屬的其它種病毒,。
3． 目前對(duì)于各發(fā)病階段，病毒在人體各組織部位的分布及持續(xù)時(shí)間等方面的基礎(chǔ)研究工作有限,。
4． 根據(jù)本品對(duì)臨床確認(rèn)SARS患者連續(xù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果：只在病程的早期，本品才有相對(duì)較高的陽(yáng)性檢出率，而在發(fā)病晚期,，本品檢測(cè)結(jié)果多數(shù)為陰性,。
5． 對(duì)于PCR檢測(cè)陰性的樣本，不能排除樣本中新型冠狀病毒的存在,。以下原因可導(dǎo)致陰性結(jié)果：
5.1 患者并未感染新型冠狀病毒,，而是由其他病原體（如病毒、細(xì)菌,、真菌等）引起發(fā)病,。
5.2 由于檢測(cè)靈敏度低，造成假陰性結(jié)果,。
5.3 由于病毒或病毒核酸可能只在一個(gè)較短的時(shí)間內(nèi)存在（樣本不同,，病毒存在的時(shí)間有差別），樣本并未在病毒或其核酸存在時(shí)被采集,。本品對(duì)臨床確診SARE患者連續(xù)監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示：只有在病程的早期,，本品才有相對(duì)較高的陽(yáng)性檢出率，而在發(fā)病的晚期,，本品檢測(cè)結(jié)果多數(shù)為陰性,。
鑒于上述原因，本品僅適用于新型冠狀病毒感染的輔助診斷,，檢測(cè)結(jié)果僅供參考,，不能單獨(dú)作為確診或排除病例的依據(jù)，最終確診應(yīng)密切結(jié)合臨床指征及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果綜合考慮,。
【注意事項(xiàng)】
1. 各項(xiàng)試驗(yàn)要參照?qǐng)?zhí)行由科技部,、衛(wèi)生部、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,、國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局聯(lián)合下發(fā)的《傳染性非典型肺炎病毒研究實(shí)驗(yàn)室暫行管理辦法》和《傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存,、使用和感染動(dòng)物模型的暫行管理辦法》的有關(guān)規(guī)定。
2. 實(shí)驗(yàn)室規(guī)范管理：應(yīng)嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范,。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按試劑配制區(qū),、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)分區(qū)使用,。工作流程：各區(qū)物品均為專用,，不得交叉使用，避免污染,。操作過程應(yīng)工作服,、帽、鞋,、手套等穿戴齊全,，避免各種試劑或樣品與皮膚接觸,。一旦發(fā)生液體的泄漏，應(yīng)立即用大量的水進(jìn)行沖洗,，如果與皮膚傷口發(fā)生接觸,，應(yīng)及時(shí)通知當(dāng)?shù)匦l(wèi)生防疫部門。
3. 人員培訓(xùn)：鑒于新型冠狀病毒感染具有較強(qiáng)的傳染性,，PCR試劑盒操作相對(duì)復(fù)雜,，試驗(yàn)步驟較多，為防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)感染,，技術(shù)人員必須經(jīng)過嚴(yán)格的安全和技術(shù)培訓(xùn),。
4．采樣注意事項(xiàng)：因新型冠狀病毒有較強(qiáng)的傳染性，能通過近距離密切接觸傳播,，采集樣本時(shí)必須做好充分的安全防護(hù),。采樣容器用專用管架盛載。采完樣后立即密封送檢,。此類標(biāo)本應(yīng)由專人專柜隔離保存,。須標(biāo)記清晰，切勿與其它病原體標(biāo)本混放,。所有待檢樣本及檢驗(yàn)過程均應(yīng)嚴(yán)格按《非典型肺炎病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)標(biāo)本采集技術(shù)指南（試行）》執(zhí)行。
5. 關(guān)于安全問題：本品試驗(yàn)操作應(yīng)嚴(yán)格遵守《傳染性非典型肺炎實(shí)驗(yàn)室生物安全操作指南》,。
（1）樣本的采集方法對(duì)采樣人員有一定的危險(xiǎn)性,，采樣人員應(yīng)高度重視安全防護(hù)。（2）實(shí)驗(yàn)室中所有各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。實(shí)驗(yàn)中用過的吸頭應(yīng)直接打入盛有 1% 次氯酸鈉的廢物缸內(nèi),，并與其它廢棄物一同在指定的地點(diǎn)以指定的方式進(jìn)行焚燒或毀棄。（3）試驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)立即清潔工作臺(tái),。工作臺(tái)及各種試驗(yàn)用品應(yīng)定期用1%次氯酸鈉,、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒。
6. 試劑盒各組份使用前請(qǐng)充分融化并搖勻,，離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用,。
