細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量控制
http://www.cde.org.cn 發(fā)布時間：2002/10/23 08:27:46 AM
細(xì)胞基質(zhì)的質(zhì)量控制
大多數(shù)現(xiàn)行疫苗是通過組織培養(yǎng)的方法制備的,，所謂組織培養(yǎng)是體外培養(yǎng)一定量的動物細(xì)胞并接種病毒,，利用病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，得到預(yù)期的病毒抗原,，然后制成疫苗,。
眾所周知,，疫苗的質(zhì)量控制是全面的質(zhì)量控制，包括原材料,、生產(chǎn)過程,、半成品、成品,，細(xì)胞基質(zhì)是疫苗生產(chǎn)的主要原材料,，其質(zhì)量控制直接影響終產(chǎn)品的安全性。本文簡要介紹WHO對細(xì)胞基質(zhì)質(zhì)量控制的要求,。
一,、細(xì)胞基質(zhì)的種類
1.原代細(xì)胞：動物組織經(jīng)胰酶消化培養(yǎng)成單層細(xì)胞，用于病毒的培養(yǎng),。如地鼠腎細(xì)胞,、沙鼠腎細(xì)胞、猴腎細(xì)胞,、兔腎細(xì)胞,、雞胚細(xì)胞等。在疫苗的生產(chǎn)中使用了40多年,，證明是安全有效的,。
優(yōu)點：1）相對簡單；2）具有廣泛的敏感性,。
缺點：1）有較嚴(yán)重的潛在的病毒污染問題,，動物的級別很難達到SPF級；2）來自不同動物的質(zhì)量和敏感性有差異,；3）動物來源越來越困難,，尤其是靈長目動物。
2.二倍體細(xì)胞：具有一定的傳代壽命,，超過一定代次,，細(xì)胞衰老。如2BS細(xì)胞,、MRC-5細(xì)胞等,。在疫苗的生產(chǎn)中使用了30多年，證明是安全有效的,。
優(yōu)點：1）能夠充分鑒定和標(biāo)準(zhǔn)化,；2）使用種子庫系統(tǒng)生產(chǎn)。
缺點：1）不易大規(guī)模生產(chǎn),，尤其是不能微載體生物反應(yīng)器,。2）對培養(yǎng)基及牛血清的要求較高。
3.傳代細(xì)胞：理論上具有無限傳代的壽命,。如Vero細(xì)胞,、BHK21細(xì)胞等,。
優(yōu)點：1）能夠充分鑒定和標(biāo)準(zhǔn)化,；2）使用種子庫系統(tǒng)生產(chǎn),。
3）可大規(guī)模生產(chǎn)，可用于微載體生物反應(yīng)器,。4）對培養(yǎng)基及牛血清的要求不高,。
缺點：理論上有致腫瘤性的危險。但已證明Vero細(xì)胞在134~150范圍內(nèi)使用,，無致腫瘤性,。
二、動物細(xì)胞的潛在危險
1.病毒污染：
1）人類或靈長目動物細(xì)胞可能攜帶潛在病毒,，如乙型肝炎病毒,、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。
2）禽類組織細(xì)胞隱藏著外源和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,，
3）嚙齒類細(xì)胞隱藏著外源和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，
2.細(xì)胞DNA
l原代細(xì)胞和二倍體細(xì)胞的殘余DNA無危險性,。
l傳代細(xì)胞系的DNA具有是其他細(xì)胞生長失控和產(chǎn)生致腫瘤活性的潛在能力,。并認(rèn)為＜10ng/劑量是安全的。
3.促生長蛋白
生產(chǎn)細(xì)胞可分泌生長因子,，認(rèn)為不構(gòu)成嚴(yán)重危險,。但使用傳代細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗，應(yīng)進行純化,，去除細(xì)胞蛋白,。
三、WHO的有關(guān)要求
（一）對所有生產(chǎn)細(xì)胞的要求
1.GMP
1）規(guī)范的操作,；
2）原材料的選擇,，細(xì)胞的供體應(yīng)無傳染病或病因不能確定的疾病。
2.細(xì)胞培養(yǎng)中的有關(guān)檢測
1）牛血清：無細(xì)菌,、真菌,、支原體和感染性病毒。有些國家還要進行無噬菌體的檢測,；有些國家使用輻射的方法滅活潛在污染的病毒,。用TSE非疫區(qū)的牛血清。
2）胰酶：無細(xì)菌,、真菌,、支原體和感染性病毒，特別進行?；蜇i細(xì)小病毒的檢測,；有些國家使用輻射的方法滅活潛在污染的病毒,。
3）生產(chǎn)結(jié)束時的檢測：無細(xì)菌、真菌,、支原體,。
4）生產(chǎn)結(jié)束時檢測外源性病毒。
（1）25%的對照細(xì)胞（不接種病毒）無病變,；（2）豚鼠紅細(xì)胞血吸附法檢測陰性,；（3）轉(zhuǎn)種人二倍體細(xì)胞、本細(xì)胞系的其他批次,、其他種屬的細(xì)胞系無病變并血吸附陰性,。
（二）對傳代細(xì)胞的要求
1.建立主代細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫
對于主代細(xì)胞庫須進行一次全面的外源因子檢定,，檢測可能存在的內(nèi)源性和外源性外源因子,，特別注意已知以潛伏狀態(tài)存在于來源物種中的因子。主代種子庫檢定合格后,，工作種子庫和生產(chǎn)細(xì)胞只進行一般的外源因子檢查,。
l無菌試驗（細(xì)菌、霉菌,、支原體）
l細(xì)胞法檢測病毒外源因子：至少用107細(xì)胞轉(zhuǎn)種人二倍體細(xì)胞,、本細(xì)胞系的其他批次、其他種屬的細(xì)胞系,，無病變并血吸附陰性,。
l用動物和雞蛋檢測病毒因子：
1）乳鼠2窩（每窩至少10只），腦內(nèi),、腹腔注射,。
2）成鼠10只，15~20克,，腦內(nèi),、腹腔注射。
3）豚鼠5只,，350~450克,，腹腔注射
4）家兔5只，1.5~2.5kg,，皮下注射
5）雞胚10只,，9~11日齡，尿腔囊,。
6）雞胚10只,，5~6日齡，卵黃囊,。
以上每組接種待檢細(xì)胞數(shù)量不少于107個,，動物觀察至少4周,，雞胚至少觀察5天，應(yīng)鍵存,。
l逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測：一般用高敏感性的細(xì)胞擴增待檢細(xì)胞培養(yǎng)物中的逆轉(zhuǎn)錄病毒,，然后進行檢測。
1）感染性檢測
2）透射電鏡檢測
3）逆轉(zhuǎn)錄酶分析
l致腫瘤性檢測
動物：1）裸鼠,；2）新生小鼠或大鼠經(jīng)抗胸腺血清處理,；3）無胸腺小鼠。
每只動物皮下注射107細(xì)胞,，以Hela細(xì)胞（106 ）作陽性對照,，有結(jié)節(jié)的觀察1~2周，解剖做病理檢查,。無結(jié)節(jié)的,，一半觀察21天，另一半觀察12周,，解剖做病理檢查,，應(yīng)為陰性。
（三） 二倍體細(xì)胞
除要傳代細(xì)胞的檢測項目外,，增加細(xì)胞染色體分析,。
檢測200個分裂中期的細(xì)胞，計算染色體數(shù)目,，檢測超二倍體、亞二倍體,、多倍體,、斷裂和結(jié)構(gòu)異常的比例。
四,、小結(jié)
細(xì)胞基質(zhì)在疫苗生產(chǎn)中必不可少,，其質(zhì)量的優(yōu)劣可直接影響疫苗的質(zhì)量。細(xì)胞基質(zhì)無外源因子污染,，是保證疫苗具有安全性的重要因素之一,。對于已使用多年并被實踐證明是安全的細(xì)胞系，可通過細(xì)胞種子庫及檢定進行質(zhì)量控制,；對于一個新的細(xì)胞系,，應(yīng)進行全面的系統(tǒng)的鑒定和檢定，確保其不含有內(nèi)源性和外源性的污染,。
