1．標(biāo)記原理

活體熒光成像技術(shù)主要有三種標(biāo)記方法,。

（1）熒光蛋白標(biāo)記：熒光蛋白適用于標(biāo)記細(xì)胞,、病毒,、基因等,，通常使用的是GFP,、EGFP、RFP（DsRed）等,；

（2）熒光染料標(biāo)記：熒光染料標(biāo)記和體外標(biāo)記方法相同,，常用的有Cy3、Cy5,、Cy5.5及Cy7,，可以標(biāo)記抗體、多肽,、小分子藥物等,；

（3）量子點(diǎn)標(biāo)記：量子點(diǎn)（quantum dot)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，是由數(shù)百到數(shù)萬(wàn)個(gè)原子組成的原子簇,，尺寸在100nm以下,，外觀恰似一極小的點(diǎn)狀物。量子點(diǎn)作為一類新型的熒光標(biāo)記材料,，其在長(zhǎng)時(shí)間生命活動(dòng)監(jiān)測(cè)及活體示蹤方面具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),。與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光試劑相比較，量子點(diǎn)熒光比有機(jī)熒光染料的發(fā)射光強(qiáng)的20倍,，穩(wěn)定性強(qiáng)100倍以上,，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高,、不易漂白,、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào),，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點(diǎn)。主要應(yīng)用在活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)熒光觀察與成像,，可以在長(zhǎng)達(dá)數(shù)天內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的分化和世系觀察, 以及細(xì)胞間,、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞器間的各種相互作用的原位實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤。不但如此,，量子點(diǎn)還可以標(biāo)記在其他需要研究的物質(zhì)上,，如藥物、特定的生物分子等,，示蹤其活動(dòng)及作用,。

2．光學(xué)原理

熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光,。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似,，紅光的穿透性在小動(dòng)物體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，隨著發(fā)光信號(hào)在體內(nèi)深度的增加,，波長(zhǎng)越接近900nm的光線穿透能力越強(qiáng),，同時(shí)可消減背景噪音的干擾，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇,。在實(shí)驗(yàn)條件允許的條件下,，應(yīng)盡量選擇發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光蛋白或染料。

1．腫瘤學(xué)

活體熒光成像技術(shù)能夠無(wú)創(chuàng)傷定量檢測(cè)小鼠的皮下瘤模型,。相對(duì)于生物發(fā)光成像技術(shù),，活體熒光成像技術(shù)檢測(cè)時(shí)間較快，只需要不到1s的時(shí)間,，同時(shí)不需要注射底物,，節(jié)約了檢測(cè)成本。但是需要選擇近紅外熒光檢測(cè)深部組織,，目前此波段的熒光蛋白種類有限,，精確定量較難。

（1）GFP標(biāo)記的肺腫瘤模型（H-460-GFP）

H-460-GFP是一個(gè)綠色熒光蛋白表達(dá)細(xì)胞系,，它起源于H-460肺小細(xì)胞肺癌,，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白基因，并由SV-40啟動(dòng)子起始基因的表達(dá),。

通過(guò)H-460-GFP皮下腫瘤模型,，建立小鼠肺癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停捎脕?lái)進(jìn)行有關(guān)抗癌藥物的篩選（圖11-3）,?？捎糜跍y(cè)量皮下腫瘤的生長(zhǎng)和監(jiān)測(cè)對(duì)潛在化學(xué)治療藥物的反應(yīng)。

   

圖11-3  左圖是接種后1w熒光成像,，右圖是3w熒光成像（上海市腫瘤研究所供圖）

（2）量子點(diǎn)標(biāo)記細(xì)胞系

通過(guò)量子點(diǎn)可以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞,，用量子點(diǎn)Qtracker® 705對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記,，皮下接種后動(dòng)態(tài)觀察其生長(zhǎng)以及變化（圖11-4）。激發(fā)光波長(zhǎng)625nm ,，散射光波長(zhǎng)680nm,。

圖11-4 量子點(diǎn)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞不同時(shí)間熒光成像

2．抗體

分子探針的一端聯(lián)有能夠和生物體內(nèi)特異靶點(diǎn)結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)（如肽類、酶的底物,、配體等）,，另一端則是熒光染料。通過(guò)Cy5.5標(biāo)記的抗體的體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn),，可見(jiàn)肝,、腎等處的分布（圖11-5）。

   

 

圖11-5   Cy5.5標(biāo)記的抗體的體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)（上海市腫瘤研究所供圖）

3． 藥學(xué)研究

熒光成像在藥物制劑學(xué)研究,，尤其是藥物靶向性研究,，藥物載體研究中有巨大優(yōu)勢(shì)。有關(guān)專家正在設(shè)計(jì)用合適的熒光染料標(biāo)記小分子藥物,，觀察藥物在動(dòng)物體內(nèi)的特異性分布和代謝情況,，尤其是中藥研究方面。

應(yīng)用透射儀從樣本底部激發(fā)光源,，可以提高活體熒光成像的靈敏度和檢測(cè)的深度,。圖11-6是應(yīng)用NIR熒光染料標(biāo)記的β淀粉酶來(lái)觀察治療Alzheimer病的藥物的治療效果，曝光時(shí)間僅為200 ms,，激發(fā)波長(zhǎng)680nm,，散射光波長(zhǎng)720nm。

圖11-6  NIR標(biāo)記的β淀粉酶成像

4．組織工程

通過(guò)發(fā)展EGFP基因表達(dá)的細(xì)胞系無(wú)創(chuàng)傷的評(píng)價(jià)組織工程的構(gòu)建,。通過(guò)EGFP標(biāo)記的組織工程細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)特制的支架上,，觀察該細(xì)胞的生長(zhǎng)和變化，從而判斷組織工程的成敗與否,。